检测胎儿组织来源类肠体的上皮通透性

本方案的意义在于测试类肠体在体外早产肠上皮模型中的总体形成概率。该技术的主要优势在于能够测量来自封闭管腔的通透性，该管腔可模拟肠道管腔环境。本方案可用于研究诱导或减轻肠漏症的相关因素。

它还可应用于内皮或血管系统，以研究可能诱导血管渗漏的条件。本方案需要一定的练习。我们建议在将整个操作流程整合之前，先分别练习各个部分。

首先，将肠段转移至含有冰冷的含两性霉素的杜氏磷酸盐缓冲液（Dulbecco's PBS）的60 × 15 毫米培养皿中，冰上浸泡20分钟。使用手术刀和剪刀将肠段切成3至5毫米的小段，取1至2段放入含有0.5至1毫升类器官生长培养基的35 × 15 毫米培养皿中，置于冰上。使用解剖显微剪刀和镊子沿肠管纵轴将其剪开。

然后使用镊子从筋膜上刮取上皮细胞。去除筋膜后，轻轻晃动培养皿以分散细胞团块。接着，使用剪去尖端的20微升移液器，将细胞和培养基以5至10微升为增量转移至基底膜基质混合液中，最终配制成285微升的溶液。

使用200微升的剪口枪头，在冰上将细胞与基底膜基质混合。混匀后，将5条50微升的细胞-基底膜基质混合物条带加入一个预热的六孔板中的一个孔内，该孔置于预热的泡沫砖上。将培养板在37摄氏度、5%二氧化碳条件下孵育10分钟，以使基底膜基质聚合并凝固。

一旦基质胶条凝固，在将培养板放回培养箱之前，向孔中加入两毫升类肠道生长培养基。将类肠道组织转移至六孔板或十二孔板的孔中后，每隔一天更换一次新鲜培养基。当类肠道组织开始良好生长时，每五到七天传代一次细胞。

进行免疫荧光染色时，向每个类肠器官孔中加入500微升含一抗的封闭缓冲液，在4摄氏度下孵育过夜。次日，移除抗体溶液，用PBS洗涤类肠器官三次。随后在1:400稀释的二抗溶液中孵育，再加入DAPI孵育，最后用PBS洗涤类肠器官三次。

为了保持类肠体的三维结构，使用薄硅橡胶片或玻璃盖玻片的剪裁小片，在底部载玻片与盖玻片之间创建0.5至1毫米的间隙。进行封片时，用70%甘油洗涤染色后的类肠体。然后，使用1微升接种环或剪去尖端的200微升枪头，将类肠体从培养板中取出，并用甘油将其封片于玻璃显微镜载玻片上。

准备一个带有透明薄膜盖的培养皿，在薄膜上加入两到四个一微升的葡聚糖-FITC液滴。使用显微操作仪，在体视显微镜下将微移液管尖端插入液体中并置于薄膜上方，然后轻轻拉动注射器，将葡聚糖-FITC吸入微移液管中。当微移液管中充满两到四微升的葡聚糖-FITC后，推动注射器以排出移液管尖端中的任何气泡。

此外，检查微量移液器中注射材料的液柱，确保无气泡，并记录微量移液器内荧光素标记右旋糖酐（Dextran-FITC）的体积。接着，在打开泵之前，先启动连接至气动泵的气源，并将泵的持续时间设定为10至15毫秒。然后旋转注射器上的旋塞阀，打开从泵通往微量移液器的通路。

将类肠器官从培养箱中取出，放入覆盖容器中，并置于预热的泡沫砖上，以尽量减少显微注射后的光照暴露。将含有类肠器官的培养皿置于体视显微镜下，调节显微操作仪的旋钮，使微量移液器尖端与水平面呈35至45度角。在显微镜下观察并识别球形的类肠器官，每皿以注射3至5个类肠器官为宜。

接下来，通过显微镜目镜观察，将移液尖端推进至目标肠类器官。然后，通过精确缓慢地调节Z轴旋钮，用微量移液器尖端穿刺肠类器官。当尖端穿过肠类器官表面时，表面会下陷并回弹，此时应停止推进。

用一只脚轻踏泵踏板，将黄绿色的葡聚糖-FITC溶液注入类肠体，直至其膨胀。记录按压次数以计算泵入体积和葡聚糖浓度。本方案通过使用免疫荧光抗体对源自胎儿组织的类肠体进行多种肠道上皮特异性生物标志物染色，证实了其具有小肠上皮来源的特征。

不同发育阶段的肠类器官如图所示。7至10天大的肠类器官体积较小且壁较厚，而适合显微注射的肠类器官则体积较大，具有明显的管腔和较薄的壁。

显微注射后两天的肠类器官仍含有大量Dextran-FITC。通过测定培养基中Dextran的浓度来评估显微注射后肠类器官的通透性。已知可增加紧密连接处膜通透性的EGTA被用作阳性对照。

葡聚糖检测实验进一步表明，脂多糖（LPS）可诱导通透性增加，且LPS浓度越高，通透性越强。固定和染色过程中最重要的是避免破坏类肠体的形态，或在操作过程中丢失类肠体。显微注射后，可收集培养基用于细胞因子检测，同时收获类肠体用于RNA测序。