使用市售蛋白质重建基于肌动蛋白的运动

通过简单的成分混合和功能化表面，本方案可重现细胞的一种关键功能——由肌动蛋白组装驱动的运动。通过改变成分组合和功能化表面的特性，可评估产生力的生化与生物物理机制。本方案的主要优势在于所有组分均可直接购买，无需具备蛋白质纯化的专业知识。

这使得非专业人员也能将该系统作为研究工具加以使用。本方案提供了一个适合本科生教学的模块，使学生能够亲手操作蛋白质，并在显微镜下观察自行制备的生物系统。学生可对系统参数进行控制和调节。

可对轨迹进行物理分析，例如朗缪尔方程分析。首先将冻干蛋白重新悬浮。将蛋白粉末在4 °C下短暂离心，使固体聚集于离心管底部。

然后根据制造商的说明加入水，并在冰上孵育至少15分钟。用移液器轻轻混匀。再在冰上放置15分钟，并再次混匀。

通过离心收集管底的溶液。重新混匀后，在冰上分装。为了去聚合在冻干和冷冻过程中形成的肌动蛋白寡聚体，用含有额外ATP、DTT和10%标记肌动蛋白的G缓冲液将重悬的肌动蛋白稀释八倍。

将样品置于冰上，间歇混匀，使其解聚至少数天至一周，然后测定蛋白质浓度。为测定重悬蛋白质的浓度，首先制备牛血清白蛋白（BSA）梯度稀释系列。按照文稿中的描述，先将2毫升和1.5毫升离心管放入试管架中。

用考马斯亮蓝试剂（Bradford Reagent）注满一支15毫升的锥形管，并将其置于冰上。取200微升考马斯亮蓝试剂，再将其排回锥形管中以润洗移液枪头。由于溶液黏稠，移液时应缓慢操作，确保液体完全进入和离开枪头，避免产生气泡。

然后使用预先润湿的枪头，将200微升考马斯亮蓝试剂加入到架子上的每个1.5毫升离心管中。并将15毫升锥形管中剩余的试剂倒回原瓶中。向第一、第三和第五行的两个2毫升离心管中分别加入适量的水。

按照文稿中所述方法，通过稀释校准的 BSA 储备液来制备 BSA 梯度稀释系列。然后通过将每种溶液 900 微升转移至下一试管中进行连续稀释。向 Bradford 试剂管中加入 800 微升水作为空白对照，并启动计时器。

在已准备好的试管中，将每种BSA标准品800微升与200微升Bradford试剂混合。混合后5分钟内，将每种标准品取适量加入一次性比色皿，于600纳米处测定吸光度。以已知BSA浓度为横坐标，测得的吸光度值为纵坐标作图，获得线性相关曲线，R值应达到0.99。

在含有 2000 µL 水的离心管中，按照文中的描述轻柔稀释重新溶解的蛋白质。立即将每种溶液 800 µL 加入已配制好的 Bradford 试剂中并混匀。在五分钟内用分光光度计读取吸光度。

使用先前构建的标准曲线计算蛋白质浓度。用于珠子包被时，将离心机预冷至四摄氏度。用移液器将50微升Xb缓冲液移入1.5毫升微量离心管中。

通过涡旋充分混匀直径为4.5微米的珠子悬浮液，并向含有Xb缓冲液的离心管中加入9微升该悬浮液。在4°C条件下，以20,000 G离心10分钟。为包被珠子，小心移除上清液，避免扰动珠子沉淀，然后用移液枪轻轻吹打，将珠子沉淀重悬于40微升含2微摩尔SpVCA的Xb缓冲液中。

现在将珠子置于干燥模块中，在18摄氏度、1000 RPM条件下振荡20分钟。随后，通过离心洗涤包被的珠子，弃去上清液，并将珠子重悬于50微升含1% BSA的冷Xb溶液中。

洗涤磁珠后，将包被的磁珠沉淀重悬于 120 微升冰冷的 Xb 缓冲液（含 1% BSA）中。置于冰上，并在冰箱或冷室中保存。按照论文所述方法配制运动反应混合液。

迅速混合反应液并启动计时器。将全部运动反应混合物点样到载玻片上。用18毫米×18毫米的盖玻片覆盖，并用小画笔蘸取熔化的VALAP密封盖玻片边缘。

为了获得整个微珠群体的平均位移速度，通过扫描整个载玻片，随时间记录相差或荧光静态图像。手动测量彗星长度并记录数值。绘制彗星长度随时间变化的曲线图。

线性拟合的斜率即为平均生长速度。在相差显微镜下选择延时录像以评估单个微珠的运动速度。根据微珠运动速度及所需分辨率，每1至10秒采集一帧图像。

使用任意图像处理程序的追踪工具获取微珠的速度和轨迹。将 BSA 标准品与 Bradford 试剂混合，得到具有梯度蓝色色调的溶液。以标准蛋白浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标绘制标准曲线，利用线性相关性确定重悬蛋白的浓度。

将SPVCA编码的微珠与含有封端蛋白的运动缓冲液混合，可在数分钟内形成肌动蛋白云。约五分钟后出现肌动蛋白云的极化，15至20分钟后产生彗星状结构。肌动蛋白彗星可持续延长数小时，但其移动速度并不恒定。

因此，珠子运动性在1小时内进行评估。无论使用帽蛋白还是凝溶胶蛋白，运动性混合物均能以类似方式产生彗星状结构。在反应开始的前20分钟内，肌动蛋白云极化形成彗星状结构，并随时间推移而延长。

通过测量随时间变化的彗星尾长度来计算位移速度。在缺乏加帽活性的情况下，肌动蛋白会在微珠周围形成云状聚集，但不会形成彗星尾结构。在整个实验过程中，对蛋白质的小心操作和移液至关重要，这不仅包括运动混合液的配制，也包括使用Bradford法测定蛋白质浓度时的操作。

通过本方案获得的彗星形成过程和珠粒运动轨迹，可用于结合软物质与统计物理分析以及生物物理实验（包括力测量和微操作）来理解其运动的物理机制。