一种基于可溶性四氮唑还原反应的检测方法，用于评估抗体的作用效果 Candida tropicalis 生物膜

本实验方案基于体外96孔板，可用于检测抗体或新型抗真菌药物对白色念珠菌生物膜中真菌细胞代谢活性的抑制作用。与其他方法相比，该技术具有高灵敏度、高准确性、高通量、可重复性强、操作简便且成本低廉等优点，适用于评估抗体或抗真菌药物对白色念珠菌生物膜形成的干预效果。该检测方法可用于评价新型药物或抗体疗法以及针对白色念珠菌生物膜的疫苗候选物的有效性，而白色念珠菌生物膜与侵袭性念珠菌病的严重程度密切相关。

该方法可用于在不同条件下，利用不同真菌菌株或抗体来源，检测新型抗真菌药物或抗体在生物膜形成或成熟过程中的作用。本实验操作将由在我实验室工作的博士研究生Pankaj Chandley先生进行演示。首先，向96孔微孔板中加入100 µL的热带念珠菌（Candida tropicalis）培养物。

使用多通道移液器，仅向最后两列加入 100 微升 RPMI 1640 MOPS 培养基。用盖子和铝箔包裹微量滴定板，并在 37 摄氏度下静置培养 24 小时。次日，使用多通道移液器小心吸除培养基。

将培养板轻轻倒置在吸水纸上，轻敲以去除残留的培养基。使用多通道移液器加入200 µL的1× PBS洗涤培养板。用多通道移液器小心吸去PBS，并用PBS重复洗涤两次。

为去除多余的 PBS，将酶标板置于生物安全柜内室温下晾干 30 分钟。用无菌的 RPMI 1640 MOPS 培养基对热灭活的血清样本进行连续稀释。向 96 孔微量板的每个孔中加入 100 µL 所选稀释度的血清。

在第10列中，仅加入RPMI 1640 MOPS培养基，作为仅含真菌的阳性对照。在第11列的所有孔中加入1:50稀释的血清，作为不含真菌但含血清的阴性对照。用盖子和铝箔纸封板后，在37°C条件下孵育24小时。

第二天，使用多通道移液器小心吸去血清后，轻敲倒置的培养板以去除任何残留的血清。用 PBS 洗涤三次，然后在生物安全柜内室温下将培养板静置干燥 30 分钟，以除去多余的 PBS。随后，将 25 毫克 XTT 溶解于 50 毫升经滤膜除菌的乳酸林格液中。

分装10毫升至不同的试管中。用铝箔包裹，并于-80 °C保存。接下来，将8.6毫克甲萘醌溶于5毫升丙酮中。

将50微升分装至100个独立的微量离心管中后，于-80摄氏度保存分装样品。取10毫升XTT，加入1微升甲萘醌，配制成1微摩尔的工作液。每孔加入100微升XTT-甲萘醌溶液至96孔微量滴定板中。

接下来，用盖子和铝箔将酶标板覆盖，于37摄氏度避光孵育2小时。最后，将每个孔中80微升的有色上清液转移至新的96孔板中，并在490纳米处读取吸光值。来自Sap2-副光滑念珠菌免疫小鼠的血清可抑制已形成热带念珠菌生物膜的成熟达65%，而来自Sap2-白念珠菌免疫小鼠的血清抑制率为45%，来自Sap2-热带念珠菌免疫小鼠的血清抑制率为55%。

总体而言，Sap2免疫血清对生物膜的抑制作用显著高于假免疫血清，而假免疫血清的抑制率分别为16%和13%（前免疫血清）。使用PBS及无血清对照时，生物膜抑制作用几乎可忽略不计。在进行洗涤步骤时应格外小心，以防止生物膜被破坏。

XTT溶液应在使用前立即配制，并迅速加入到培养板中。通过该方法，研究人员可在不同实验条件下，利用不同真菌菌株，评估新型抗真菌药物、候选疫苗或抗体对白色念珠菌生物膜形成及成熟过程的影响。