体外 研究结膜杯状细胞性别差异的方法

通过研究杯状细胞在原代培养中的功能，我们获得了关于眼表健康性别差异机制的宝贵见解。我们在已建立的结膜杯状细胞原代培养方法基础上进行了改进，去除了体系中的激素和雌激素类物质，从而实现对性激素水平的更精确控制。这一改进提高了研究结果的准确性和可靠性。

细胞内钙离子浓度测定是一种用于研究杯状细胞在不同刺激条件下功能及其所激活的细胞内信号通路的方法。该技术可拓展应用于眼表疾病（如眼部过敏、干眼症或结膜炎）的药物研发。该技术有助于在特定激素水平下，筛选各种分子对杯状细胞的作用效果。

初次接触该技术的人常在分离结膜组织与结缔组织时遇到困难。我们的建议是密切注意组织的质地和物理特性。结膜应具有弹性且呈半透明状，而结缔组织通常颜色较浅，呈棉纤维样。

首先，使用无菌手术刀将人结膜组织切成一立方毫米大小的组织块。在六孔板中，每孔接种四个组织块，每孔内含一毫升完全RPMI培养基。确保将组织块固定于培养板底部。

将组织块置于37摄氏度、5%二氧化碳和95%空气条件下孵育。每两天更换一次培养基。接种后72小时，移除组织块，并继续孵育，直至杯状细胞达到70%至80%融合度。

接着，用 PBS 清洗细胞，并加入 0.05% 胰蛋白酶 EDTA 以使细胞从培养板底部脱落。在显微镜下观察细胞脱落情况。一旦细胞脱落，立即加入完全 RPMI 培养基以灭活胰蛋白酶。

将细胞悬液在150 G条件下离心5分钟，并将沉淀重悬于不含酚红的RPMI培养基中。随后将细胞悬液重新接种至玻璃底培养皿中，用于细胞内钙离子浓度的测定。进行Fura-2 AM负载时，向含有杯状细胞的玻璃底培养皿中加入含有0.5% HEPES、0.5% BSA和0.5微摩尔Fura-2 AM、8微摩尔Pluronic酸F127以及250微摩尔磺吡酮的Krebs-Ringer碳酸氢盐缓冲液。

将细胞在 37 摄氏度孵育一小时，避光。孵育结束后，用含有 250 微摩尔舒林普罗宗的克雷布斯-林格碳酸氢盐缓冲液洗涤细胞。进行细胞内钙浓度测定时，将载有负载 Fura-2 的细胞的培养皿置于显微镜下。

然后使用200倍放大倍数。选择一个包含20至50个细胞的代表性视野。利用自由绘制功能，围绕每个细胞绘制轮廓，以将其与背景荧光区分开，并等待软件自动从测量值中扣除背景荧光。

单击“开始实验”按钮，等待8到15秒以确定细胞的基础钙水平。然后小心加入胆碱能激动剂卡巴胆碱，并继续测量至少120秒，或直至钙水平恢复至基线。根据细胞内钙浓度峰值的变化，计算每个细胞在最初8到15秒测量期间的平均基础钙水平。

从数据集中剔除平均基础钙水平等于或高于 500 纳摩尔的细胞。接着，计算每个细胞的最大胞内钙浓度。然后，将同一细胞的最大实测胞内浓度减去其基础钙水平值。

最后，计算培养皿中所有细胞的峰值胞内钙离子浓度变化的平均值。通过免疫荧光染色验证人结膜杯状细胞的纯度，所用抗体针对杯状细胞标志物——细胞角蛋白和蜗牛凝集素1（Helix pomatia lectin 1）。Fura-2 AM 检测结果显示，在含1% BSA的酚红-free RPMI培养基与完全RPMI培养基中孵育的细胞之间无显著差异。

然而，在比较改良型RPMI培养基组与完全RPMI培养基组时，观察到羧甲基胆碱诱导的细胞内钙反应显著增强。最重要的是获得细胞密度足够高的原代人杯状细胞培养物。在培养过程中，应确保组织块牢固贴附于培养板，以实现有效的组织外生长。

研究人员可在刺激前向细胞施加各种抑制剂，靶向受体或信号分子，以探究特定通路的参与情况。其他反映杯状细胞功能的参数，如黏蛋白分泌以及丝裂原活化蛋白激酶的失活，也可进行评估。这些互补性检测可提供杯状细胞对不同刺激反应的全面理解。