长期与短期造血干细胞的分离方法

长期和短期造血干细胞（HSC）的分离方法将有助于研究人员更好地理解HSC区室中细胞更新机制及异质性的生物学基础。已鉴定出一种转录因子Hoxb5，其可能是长期HSC的特异性标志物。基于此发现，研究人员建立了Hoxb5报告基因小鼠品系，并成功分离出长期和短期造血干细胞。

开始收集供体骨髓细胞时，用70%乙醇对研钵和研杵进行灭菌，并使其完全干燥。用含有钙、镁离子-free PBS补充剂的细胞染色缓冲液对研钵和研杵进行平衡。将从供体雄性Hoxb5-tri-mCherry小鼠中分离的骨骼放入研钵中，并加入3毫升细胞染色缓冲液。

用研杵将骨组织捣开，然后通过轻柔吹打分散细胞团块，并将细胞悬液经100微米细胞滤网过滤至50毫升离心管中。用新鲜的细胞染色缓冲液重复此操作，直至溶液变澄清。通常重复三次即可获得澄清的溶液。

从CD45.1.2同源型小鼠中分离出股骨和胫骨后，用锋利的无菌剪刀剪去骨骼两端。使用装有5毫升冰浴细胞悬浮缓冲液的23号针头和注射器，将骨髓冲洗至含有细胞悬浮缓冲液的无菌细胞培养皿中。通过轻柔吹打使细胞团块分散，然后用P1000移液器将细胞悬液经40微米细胞滤网过滤。

进行设门设置时，按照文中提供的说明制备样品，并将400微升样品转移至带有35微米细胞滤网扣盖的圆底聚苯乙烯试管中。在分析前，根据试剂生产商的说明，制备并加入死细胞去除试剂。随后，按照仪器生产商的说明，打开流式细胞仪并启动分析软件。

然后，按下“加载”以开始采集数据。在排除双细胞、死细胞和谱系标记阳性细胞后，圈选谱系标记阴性、c-kit阳性、Sca-1阳性的细胞群。接着，进一步排除Flk2阳性细胞群。

随后，在 CD150 阳性、CD34 阴性或低表达群体中圈选 Hoxb5 阳性或 Hoxb5 阴性的 pHSCs。接下来，准备一个 1.5 毫升低蛋白结合离心管，加入 600 微升不含钙和镁的 PBS，其中添加 10% 经热灭活的 FBS。为进行 Hoxb5 阳性或 Hoxb5 阴性 pHSCs 的分选，将已准备的 1.5 毫升低蛋白结合管置于分选收集装置上，按照前述圈选策略，将 Hoxb5 阳性或 Hoxb5 阴性的 pHSCs 分选至该管中。

在第一次分选时，使用分选精度模式下的得率。将预先准备好的饲养细胞置于自动化细胞沉积单元的载物台上，使用96孔板。然后，将1.5毫升低蛋白结合管置于流式细胞仪的上样口。

使用前述的分选策略，将 Hoxb5 阳性或 Hoxb5 阴性的 pHSCs 与饲养细胞共同分选至 96 孔板中。分选 10 个 Hoxb5 阳性或 Hoxb5 阴性的 pHSCs，以检测其自我更新能力。供体 Hoxb5-tri-mCherry 小鼠骨髓分析的流式细胞术图显示，在定义为谱系阴性、c-kit 阳性、Sca-1 阳性、CD150 阳性、CD34 阴性或弱阳性、Flk2 阴性的 pHSC 亚群中，约有 20% 至 25% 的细胞为 Hoxb5 阳性 pHSCs。

此处展示的是受体小鼠外周血分析的代表性流式细胞术图谱。此外，受体小鼠在初次移植后的外周血分析显示，尽管Hoxb5阳性与Hoxb5阴性的pHSCs在移植后四周表现出相似的供体嵌合水平，但持续性造血仅在Hoxb5阳性pHSC受体小鼠中被观察到。Hoxb5阴性的HSCs在移植八周后开始丧失产生造血细胞的能力。

在二次移植分析中，仅Hoxb5阳性的pHSC受体小鼠表现出强大的造血功能。相比之下，在Hoxb5阴性pHSC受体小鼠中几乎观察不到供体细胞，提示Hoxb5阴性pHSC在初次移植后16周内已丧失自我更新能力。该实验方案通常需要9至12小时，因此在整个操作过程中应尽可能将样品保持在4摄氏度，以维持细胞活性。