利用清醒状态下闭合性头部损伤的轻度创伤性脑损伤模型评估突触可塑性的变化

本方案提供了一种明确的方法，用于利用ACHI模型制备接受重复性轻度创伤性脑损伤（r-mTBI）动物的高质量横断面海马脑片。ACHI模型可诱导轻度损伤，不涉及颅骨骨折或出血、开颅手术以及麻醉剂的使用。

此外，该方法可实现稳定的电生理记录。这些技术可用于研究反复轻度创伤性脑损伤后突触可塑性的变化，而此类损伤的病因在很大程度上尚不清楚，相关研究有望为治疗策略提供依据。本次实验操作将由本实验室的硕士研究生 Allyson Gross 和博士后研究员 Dr. Eric Eyolfson 进行演示。

将大鼠放入固定锥形管中，确保其鼻部和鼻孔靠近锥形管的小开口，以保证充分通气。用塑料发夹夹住锥形管尾端，防止大鼠移动。手动将头盔置于固定好的大鼠正中位置，使定位盘对准左侧顶叶。

接下来，将大鼠放置在泡沫垫上，然后手动将撞击器设置为伸出位置。手动降低撞击器的尖端，使其接触头盔上的目标圆盘。随后将撞击器设置为缩回位置，使撞击器从头盔上方撤回10毫米。

使用体视定位臂上的旋钮，将撞击头降低10毫米，再次接触头盔上的定位盘。然后拨动撞击开关，使动物头部以每秒6米的速度在10毫米距离内快速加速。设备启动后，立即从固定锥中取出动物，进行即时神经功能评估方案（NAP）。

处死小鼠后，解剖出脑组织并将其放置在倒置的培养皿中湿润的滤纸上。使用锋利的手术刀去除小脑和前额叶皮层以吸去脑组织表面液体。沿脑正中线切割，分离两个半球。

为制备海马横切片，将一侧半脑置于内侧表面，将手术刀向内倾斜约30度，从脑的背侧表面切下一层薄片，以获得一个平整的表面用于固定在切片机活塞上。将脑组织翻转至背侧朝下，轻轻用干燥滤纸吸去脑组织表面多余的ACSF。随后，使用氰基丙烯酸酯胶将脑组织的背侧表面粘附于活塞上，使腹侧朝上。

将活塞的外管延伸至脑组织上方，并将液态琼脂糖倒入管中，直至完全覆盖脑组织。通过在活塞管上夹紧冷却块，迅速使琼脂糖凝固。将活塞放入切片机的腔室中，并用螺丝固定腔室。

固定刀片后，向切片机腔室中加入冰冷的含氧人工脑脊液（ACSF）。在切片机上，将切削速度设为4，振幅设为6，并将连续单切模式开关切换至“连续”状态。然后按下“开始”按钮，以400微米厚度对脑组织进行切片。

当切片机对脑组织进行切片时，使用大直径的巴斯德移液管将每一片切片转移至盛有充氧人工脑脊液（ACSF）的恢复浴中。让切片在32摄氏度下恢复30分钟，随后在室温下继续恢复30分钟。重复这些步骤，以制备另一侧半脑的切片。

使用市售的微电极拉制仪，从长度为10厘米、外径为1.5毫米、内径为1.1毫米的硼硅酸盐玻璃毛细管中拉制1至2兆欧的记录电极。使用巴斯德移液管将海马脑片从恢复浴槽转移至灌流着含碳合气的ACSF、并维持在30摄氏度的记录室中。调整脑片方向，使齿状回及颗粒细胞层在视野中清晰可见。

使用直立显微镜通过斜向光学系统观察齿状回。将同心双极刺激电极置于分子层中三分之一处，以激活内侧穿通通路（MPP）纤维。然后，将充满人工脑脊液（ACSF）的玻璃微电极置于MPP中。

开始时将电极放置得较远，因为接触组织会损伤纤维。待刺激电极和记录电极定位后，使用放大器、数字化仪和记录软件观察诱发出的场反应。通过电流脉冲刺激组织，寻找合适的场兴奋性突触后电位（field EPSP），确保其幅度至少达到0.7毫伏（mV），且具有明显小于场EPSP的纤维锋电位。

逐渐增加并设定刺激强度，直至场兴奋性突触后电位（fEPSP）达到最大振幅的70%。接下来，以0.067赫兹的频率给予0.12毫秒的脉冲，建立持续20分钟的稳定预处理基线。对于状态稳定的脑片，fEPSP的初始斜率变异应小于10%，且通过绘制的场EPSP斜率数据点拟合出的最佳直线斜率应小于0.5。

利用成对脉冲刺激并构建刺激/反应的输入/输出曲线，测定基础突触特性的变化。对于成对脉冲测试，在0.033赫兹频率下施加一系列间隔为50毫秒的成对脉冲。对于输入/输出曲线，在0.033赫兹频率下施加一系列持续时间从0.0至0.24毫秒逐渐增加的刺激，以绘制场兴奋性突触后电位（fEPSP）反应幅度的变化。

为了研究主要依赖CB1受体激活的长时程抑制，采用10赫兹频率给予6,000次脉冲刺激。在条件刺激后记录阶段，继续使用持续60分钟的单脉冲刺激，脉冲时长为0.12毫秒，频率为0.067赫兹。在完成条件刺激后记录后，给予成对脉冲刺激，随后进行输入/输出曲线测定。

将这些记录与基线数据进行比较，以观察突触前释放特性的改变，并评估脑片在长期记录中的健康状况。在分析过程中，应遵循剔除标准，以确定突触前可塑性数据集中各个脑片数据的保留情况。若脑片在 Conditioning 前基线期的场兴奋性突触后电位（fEPSP）斜率的最优拟合直线呈现明显斜率、基线期不稳定，或 Conditioning 后时期不稳定，则应予以剔除。

在基线水平时，神经功能评估方案（NAP）评分显示假手术组与重复性轻度创伤性脑损伤（mTBI）大鼠之间无差异。在所有清醒状态下闭合性头部损伤操作完成后，重复性mTBI大鼠在NAP任务中的表现显著差于假手术组，表明产生了虽轻微但具有显著性的行为功能缺陷。给予一系列成对脉冲刺激，并计算第二个场兴奋性突触后电位（fEPSP）相对于第一个fEPSP的幅度比值。

假手术组与重复性轻度创伤性脑损伤（mTBI）大鼠之间的成对脉冲比值无显著差异，表明重复性轻度脑损伤并未改变内侧穿通路径（MPP）向齿状回输入的基本突触生理特性。当采用10赫兹刺激方案诱导长时程抑制（LTD）时，在损伤后第一天，MPP向齿状回的输入在维持长时程度抑制方面的能力出现短暂但显著的下降。然而，至损伤后第七天，假手术组与重复性mTBI动物的脑片表现出相当的长时程抑制水平，尽管重复性mTBI动物显示出长时程抑制略有增强的趋势。

提前规划解剖和切片过程对于成功制备具有活性的海马脑片并获得稳定的电生理记录至关重要。该方法可建立一个稳定的实验平台，用于研究创伤性脑损伤（TBI）的病理生理机制，并探索新的治疗途径。从取出脑组织到将其定位并在压缩膜中进行横切以获取横断面海马脑片的每一步操作都至关重要，电极在齿状回中的精确定位同样关键。