研究组蛋白修饰酶与转录因子之间的相互作用 在体 通过荧光共振能量转移
2022年10月14日
荧光共振能量转移（FRET）是一种用于在活细胞中检测蛋白质相互作用的成像技术。本文介绍了一种FRET实验方案，用于研究组蛋白修饰酶与转录因子之间的相互作用，后者可将这些酶招募至靶启动子，从而在植物组织中实现基因表达的表观遗传调控。
该方法有助于解答蛋白质-蛋白质相互作用相关的问题，使我们能够直接检测活细胞内两个相距10纳米以内的蛋白质。该技术的主要优势在于操作简单且易于重复，同时仅需现代实验室中常见的基本材料。
该方法可用于任何在目标蛋白处发生暂时性扩散的活体组织或培养细胞。如果您首次使用此技术，建议先使用阳性对照和阴性对照对系统进行测试。首先，将 Nicotiana benthamiana 种子高密度播种于装有湿润土壤的花盆中。
将播种的种子置于设定为23摄氏度的生长室中培养。当真叶直径达到0.3至0.5厘米时，将幼苗转移至较大的花盆中，并在相同参数的同一生长室中继续培养。接下来，通过将含有FRET构建体的每种农杆菌单菌落接种于5毫升LB培养基（添加抗生素和150 µM乙酰丁香酮）中，来制备用于农杆菌浸润的细菌细胞。
在28摄氏度下将培养物孵育过夜。孵育结束后，在室温下以3,000 G离心5分钟。用农杆菌浸润缓冲液重悬细胞，使OD 600达到0.5。
进行双载体农杆菌浸润时，将重悬的菌液与含有相应载体的菌液按1:1的体积比混合。在28摄氏度下孵育30分钟至1小时。进行农杆菌浸润操作时，将菌液加入1毫升无针头注射器中。
戴上手套，用手指按住本氏烟草（Nicotiana benthamiana）完全展开叶片的近轴面，同时将注射器喷嘴轻轻但牢固地压在叶片的远轴面。每片叶上注射最多四个位点，每株植物处理三片叶，每种细菌培养物处理两到三株植物。将农杆菌浸润后的植物置于与前述相同的生长室条件下培养24至36小时。
在侵染24至36小时后，使用刀片将每片农杆菌侵染的叶片在叶脉之间切成2×4毫米的小片。将叶片小片放置在载玻片上，使叶片的远轴面朝上。在叶片小片上滴加一滴水，然后盖上盖玻片。
轻轻敲击盖玻片以去除气泡。然后打开显微镜和激光器，将载玻片放入显微镜载物台夹持器中。
为了设置SE-FRET的参数，请打开多维采集工具。然后设置供体通道，使用405纳米的激发激光激发供体荧光蛋白GFP，并将发射滤光片设置为400至597纳米。设置受体通道，使用561纳米的激发激光激发受体荧光蛋白mRFP，并将发射滤光片设置为400至597纳米。
设置FRET通道，使用405纳米激发激光和597至617纳米发射滤光片，以激发供体并检测受体荧光染料的发射信号。将供体激发强度设为最低水平，以在避免光漂白的同时观察FRET现象。激发供体，并扫描含有预期受体荧光信号的细胞。
选择包含目标荧光信号的区域。通过点击拍摄按钮获取SE-FRET图像序列。为设置AB-FRET参数，请使用为SE-FRET设定的供体和受体通道参数，但需关闭FRET通道。
然后准备设置受体mRFP光漂白的参数。确保在采集五张图像后开始漂白。每个区域漂白设置200次迭代。
保持561纳米波长的激光强度为100%。漂白时间维持45秒。确保扫描速度为512×512像素，扫描频率为400赫兹。
搜索并绘制需要漂白的细胞区域，然后按下“开始实验”按钮以启动漂白。对于阳性对照，在采集五幅图像后开始漂白，感兴趣区域将变为绿色。检查平均 ROI 以确认 mRFP 的荧光强度正在降低，而 GFP 的荧光强度正在增加。
或者，检查布局，结果显示 mRFP 正在发生光漂白，而 GFP 信号正在增强。为分析 SE-FRET 数据，请使用 ImageJ 软件。打开图像并创建仅含供体的图像栈。
将图像以8位格式保存为TIF文件。同样，创建仅受体的图像栈，然后创建供体与受体的合并图像栈。接着，使用PixFRET插件生成SE-FRET效率图像。
打开创建的图像序列，通过减去光谱串扰生成校正后的FRET图像。以伪彩色图像形式呈现结果。为分析AB-FRET数据，使用以下公式计算AB-FRET百分比，即mRFP光漂白后GFP发射光强度增加的百分比。
通过SE-FRET研究了组蛋白去泛素化酶OTLD1与转录因子LSH10之间特异性的蛋白质-蛋白质相互作用。同时在三个通道中记录了细胞核，并生成伪彩色标度以显示SE-FRET效率。颜色从蓝色到红色的转变对应于FRET效率的增加以及蛋白质间距离的减小。
LSH10与OTLD1共表达后的SE-FRET强度与阳性对照mRFP-GFP所观察到的结果相当。在阴性对照中（如OTLD1、mRFP与LSH4-GFP的共表达，或游离的mRFP与LSH10-GFP共表达）未观察到SE-FRET信号。AB-FRET图像显示，在RFP受体被光漂白后，LSH10-GFP与OTLD1-mRFP共表达导致GFP供体荧光增强。
在阳性对照中观察到供体荧光出现类似的增强，而在受体荧光失活时，阴性对照中未观察到此现象。AB-FRET 数据的定量分析表明，共表达 LSH10 和 OTLD1 后，供体荧光显著增加，具有统计学意义。阳性对照的 AB-FRET 百分比约为 30%，而阴性对照则未产生任何 AB-FRET 信号。
SE-FRET 和 AB-FRET 在细胞核中显示出信号，这与转录因子组蛋白修饰酶复合物的亚细胞定位以及 GFP-MRFP 蛋白的核质穿梭特性一致。在进行实验方案之前，最重要的是根据共聚焦纳米显微镜的型号，选择正确的供体-受体表达组合。完成实验并进行迭代后，仅需 24 至 36 小时即可获得结果。
观看本视频后，读者应能较好地理解如何利用FRET技术研究蛋白质-蛋白质相互作用。
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概述
本研究提出了一种FRET实验方案，用于研究活体植物细胞内的蛋白质相互作用，重点探讨组蛋白修饰酶与参与基因调控的转录因子之间的关联。以模式植物烟草（Nicotiana benthamiana）为实验系统，结果表明该成像技术在分析蛋白质-蛋白质相互作用及其动态过程方面具有重要潜力。
关键研究组成部分
研究领域
- 蛋白质-蛋白质相互作用
- 基因表达调控
- 植物中的表观遗传修饰
背景
- 理解组蛋白修饰酶与转录因子的关联对于阐明基因调控机制至关重要。
- 荧光共振能量转移（FRET）技术可用于检测活细胞中纳米级距离内的分子相互作用。
- 该方法可标准化应用于植物研究中的多种生物学场景。
使用的方法
- 荧光共振能量转移（FRET）成像
- 以本氏烟草（Nicotiana benthamiana）作为生物系统
- 利用农杆菌浸润法进行蛋白表达与分析
主要结果
- 利用SE-FRET成功实现了OTLD1与LSH10相互作用的可视化。
- 对照实验验证了所观察到的相互作用的特异性。
- 定量分析支持了关于蛋白质接近性及相互作用动态特性的结论。
结论
- 该研究展示了荧光共振能量转移（FRET）在分析植物系统中蛋白质相互作用方面的应用价值。
- 此项研究有助于深入理解基因表达中的表观遗传调控机制。
常见问题
行业重要性概述
在活细胞中直接定量组蛋白修饰酶与转录因子之间的相互作用，是表观遗传药物发现中靶点验证的关键挑战。基于FRET的检测技术可识别10 nm范围内的蛋白质邻近关系，有助于阐明作用机制、降低研发风险，并提高早期发现阶段的预测可信度。该技术通过明确与基因调控相关的功能性蛋白质复合物，支持药物研发组合的决策。
生物制药研发中的战略应用
早期发现与靶点验证
- 能够在天然细胞环境中直接研究蛋白质-蛋白质相互作用。
- 通过确认体内复合物的形成，支持表观遗传学靶点的功能验证。
- 减少基因调控通路分析中的机制不确定性。
- 提高将靶点推进筛选流程的预测可信度。
筛选与检测方法开发
- 有助于为下游化合物筛选制备经过验证的生物系统。
- 提供蛋白质相互作用效率的定量、可重复的检测结果。
- 通过使用阳性和阴性对照实现检测标准化，获得可靠的数据。
- 支持在多种蛋白质对之间进行可扩展性和平台重复利用。
转化与临床前研究
- 将机制性发现与疾病相关的染色质调控通路相整合。
- 确保从发现阶段的相互作用图谱到临床前模型验证的连续性。
- 通过确认蛋白质复合物的体内相关性，降低转化研究的风险。
流程与工作流整合
这种基于FRET的方法整合了早期发现与先导物识别的界面，为从假设驱动的靶点验证到定量筛选工作流程提供了桥梁。
- 发现生物学：通过在活体组织中可视化直接的蛋白质相互作用，支持假设验证。
- 筛选：提供可重复、定量的FRET效率测量，确保检测的就绪性。
- 分析：实现在不同实验条件下相互作用强度的统计学比较。
- 转化研究：在生物学背景支持下，将机制性见解与疾病相关的染色质调控相联系。
- 企业级复用：可适用于多种蛋白质对和模型系统，具有广泛的研发适用性。
运营与企业影响
- 科学价值：提高靶点验证中的预测可信度，降低机制不确定性。
- 操作价值：提供标准化、可重复的实验方案，兼容常规实验室基础设施。
- 战略价值：通过早期明确作用机制，指导推进或终止决策，降低后期生物学风险。
- 项目组合影响：实现对表观遗传靶点及复合物的风险校正优先排序，推动其进一步开发。
实施注意事项
- 需要具备荧光显微镜和蛋白质标记策略方面的专业知识。
- 需要能够使用共聚焦纳米显微镜及兼容的FRET成像平台。
- 要求严格使用阳性和阴性对照以实现检测标准化。
- 通过适当的设计，该方法可适用于植物系统，并可能拓展至哺乳动物系统。
- 依赖于供体-受体荧光团组合与成像系统的光谱兼容性。
