使用荧光激活细胞核分选技术对脂肪组织进行脂肪细胞特异性ATAC-Seq

ATAC-seq 是一种用于理解基因表达调控机制的强大技术。然而，由于脂肪组织含有大量脂质、线粒体污染程度高以及细胞异质性强，难以应用该技术。在本方案中，通过使用荧光激活细胞核分选技术进行脂肪细胞特异性的 ATAC-测序，获得了高质量数据，并将线粒体 DNA 污染降至最低。

该方法也可用于其他组织，只要存在细胞类型特异性的 Cre 小鼠品系，并且具有核标记的转基因报告基因小鼠品系。开始细胞核分离时，将玻璃 Dounce 匀浆器置于冰上预冷，每个样品使用一个玻璃 Dounce 匀浆器。然后，向每个玻璃 Dounce 匀浆器中加入 7 毫升 NPB 混合液。

然后，取50至100毫克冷冻的脂肪组织放入玻璃Dounce匀浆器中，用一把长柄剪刀将其剪成若干小块。所有样品均先用松散研杵研磨10次，再用紧密研杵研磨10次。将匀浆液通过100微米滤网过滤至新的50毫升离心管中，随后将过滤后的匀浆液转移至15毫升离心管中进行离心。

去除上清液后，用500微升PBS-N通过轻轻但彻底地用手指敲击重悬沉淀。接着，将悬液通过40微米滤网过滤至50毫升离心管中，并用250微升PBS-N冲洗滤网。使用微量移液器将过滤后的细胞核悬液转移至荧光激活细胞分选（FACS）管中。

在新的1.5毫升离心管中加入500微升PBS-N，以制备收集管，并反复倒置数次，使缓冲液润湿管内所有表面。短暂离心以使液体沉降至管底，随后将离心管置于冰上，待分选时使用。进行FACS分析时，使用FSC-A/FSC-H设门排除双联体，并使用FSC-A/SSC-A排除小或大颗粒碎片。

圈选mCherry/GFP阳性脂肪细胞核群体，并将每个预先准备的收集管中各收集10,000个细胞核。分选后细胞核制备时，向每个收集管中加入500 µL PBS-N，轻轻倒置管子数次以混匀，随后在4 °C条件下以200 ×g离心10分钟。彻底去除上清液。

配制25微升Tn5预混液：将12.5微升2x标签化DNA缓冲液（TD缓冲液）、1.25微升Tn5转座酶（TDE I酶）和11.25微升无核酸酶水混合均匀。随后，向每个细胞核沉淀中加入25微升Tn5预混液，通过轻柔吹打重悬沉淀。使用恒温混匀仪，在37摄氏度、600 RPM条件下孵育30分钟。

向25微升Tn5转座复合物重悬液中加入25微升无核酸酶水，使终体积为50微升。然后加入250微升PB缓冲液和5微升pH 5.2的3 M醋酸钠溶液。将混合物转移至随试剂盒提供的离心柱中，在室温下于17,900 G离心1分钟。

弃去穿流液后，将离心柱重新放回原来的收集管中。向管中加入750微升含有无水乙醇的PE缓冲液。离心柱子，弃去穿流液，并将离心柱重新放回同一收集管中。

离心管子，弃去含有流穿液的收集管。为了扩增经转座的DNA片段，配制PCR主混合液，但不要加入独特的Ad2.n条形码引物。

进行PCR反应。进行定量PCR（qPCR）。检查扩增曲线，并通过估算达到最大值约35%所需的循环数，确定需要增加的PCR循环次数。

根据计算结果，对剩余的45微升PCR反应体系进行PCR扩增。按照前述步骤，用20微升洗脱缓冲液（EB缓冲液）洗脱扩增后的DNA片段。将洗脱得到的DNA转移至新的PCR管中，并加入80微升EB缓冲液，使总体积调整至100微升。随后加入55微升SPRI磁珠，通过移液器吹打混匀。室温孵育5分钟后，将反应管置于小型磁力架上分离磁珠，持续5分钟。

完成后，将150微升上清液转移至新的PCR管中，加入95微升SPRI磁珠，并用移液器吹打混匀。反应孵育5分钟后，将磁珠置于小型磁力架上进行分离。小心弃去上清液，用200微升70%乙醇洗涤磁珠1分钟。

再重复洗涤两次。最后一次洗涤后，在1000 G下离心试管1分钟。用移液器吸出残留的乙醇，并在PCR仪上打开盖子于37摄氏度干燥沉淀2分钟。

干燥后，用移液器将沉淀重悬于20 µL洗脱缓冲液EB中，在室温下孵育5分钟。将反应管置于微型磁力架上分离磁珠5分钟，然后将含有最终文库的上清液18 µL转移至新的1.5 mL离心管中。在Adipoq-NuTRAP小鼠的脂肪组织分离的细胞核中，mCherry标记和GFP标记的脂肪细胞核可与其他细胞类型的细胞核区分开来。

根据脂肪库类型的不同，eWAT 中的脂肪细胞组分差异约为 50%，iWAT 中为 30%，BAT 中为 65%。需要超过 15 个 PCR 循环的样本表明其质量较低。ATAC-seq 文库的大小分布分析显示出多个峰，分别对应无核小体区域（NFR）以及单核小体、双核小体和多核小体，其平均大小约为 500 至 800 个碱基对。

质量较差的样品通常主要显示核小体游离区（NFR），且无或仅有少量核小体峰。通过qRT-PCR分析进行的质量检测结果显示，在脂肪细胞标志基因（如Adipoq、Fabp4、Plin1和Pnpla2）附近的阳性基因组元件富集程度达到10至20倍，而阴性对照则未显示富集。在棕色脂肪组织（BAT）中特异性观察到产热基因Ucp1的富集。

线粒体读段占比低于2%，峰下区域的比值约为18%至44%。在所有脂肪组织库中，靠近脂肪细胞标志基因（如Adipoq、Fabp4和Plin1）的位置均显示出多个信号噪声比较高的强峰。在BAT样本中，棕色脂肪细胞标志基因Ucp1位点处观察到明显的ATAC-seq峰。本实验方案最关键的要素是细胞核的质量。

使用高质量的组织样本并在整个实验过程中轻柔处理细胞核非常重要，尤其是在离心和分选后的重悬步骤中。需要注意的是，本方案依赖于带有细胞核标记的转基因报告小鼠。此处使用了 NuTRAP 小鼠，但任何类似的系统均可使用。

利用我们的流式细胞术数据，可以进行计算多重分析，以发现调控生物环境中基因表达的关键转录组因子。