小鼠与人泪腺类器官的建立、维持、分化、遗传操作及移植

利用泪腺类器官，可以研究特定基因如何调控泪腺的稳态。此外，类器官还可用于再生医学。成体干细胞来源的泪腺类器官技术的主要优势在于，能够培养和研究健康且未发生转化的泪腺上皮细胞。

这些类器官最终可用于治疗干眼症患者。首先准备实验所需的培养基和材料，然后在实验前将消化培养基的所有组分混合均匀。用该培养基预先润湿手术刀片，以防止组织碎片粘附其上。

从培养基中取出小鼠泪腺组织，放入培养皿中，用预先润湿的手术刀将其切碎。当组织块小于0.5立方毫米时，用手术刀将其从培养皿上刮下，并转移至含有消化液的15毫升离心管中。对于非常小的人类活检样本，可直接将其放入消化液中，无需切碎。

将含有组织块的15毫升离心管置于37摄氏度水浴中孵育最多15分钟。在此期间，用火焰将巴斯德吸管尖端拉细，并用基础培养基预润湿。为促进解离过程，每隔5分钟使用预润湿并拉细的巴斯德吸管将剪碎的组织上下吹打一次。

当在显微镜下观察到大量单细胞和少量小细胞团时，加入 10 毫升基础培养基以终止消化。在 400×g 离心 5 分钟后，弃去上清液，并将沉淀物重悬于 10 毫升基础培养基中，重复洗涤并再次离心收集细胞。通过 70 微米细胞筛过滤剪碎的混合物，以去除未消化的大块组织和残留的胶原纤维。

将洗脱液在400g下离心5分钟。去除上清液后，将细胞沉淀重悬于100微升冷的细胞外基质（ECM）中，用于单个小鼠泪腺；或重悬于50微升冷的ECM中，用于人活检组织，操作过程中避免产生气泡。使用P200移液器将每孔最多100微升细胞悬液接种至12孔悬浮培养板中，每孔形成约20微升的液滴。

将培养板倒置放入37摄氏度的加湿培养箱中，孵育20至30分钟，以使ECM凝固。待ECM完全凝固后，在12孔板的每个孔中加入约1毫升室温小鼠扩增培养基。新鲜配制1毫升含诱导泪腺类器官分泌的各组分的人类分化培养基。

在自动明场延时显微镜上，设置好培养板中需要成像的位置，时间间隔为五分钟，持续时间为四小时。确保每个位置均能完整看到整个细胞外基质（ECM）液滴。开始成像前，将待成像孔中的培养基移除，操作时不要将培养板从显微镜上移开，并立即替换为新配制的、充分重悬的人类分化培养基，其中包含佛司可林（forskolin）和去甲肾上腺素（noradrenaline）等化合物。

作为阴性对照，设置一个含有新鲜分化培养基的孔。点击显微镜上的运行按钮，并在四小时后分析结果。按照文中所述方法解离类器官后，弃去上清液。

将细胞重悬于80 µL电穿孔缓冲液中。在1.5 mL离心管中，制备实验所需的质粒。将质粒加入细胞中，通过上下吹打充分混匀。

根据打孔脉冲和转移脉冲的参数设置电穿孔仪。将含有质粒的细胞加入电穿孔比色皿中。立即测量电阻，电阻值应在 0.3 安培至 0.55 安培之间，并立即进行电穿孔。

完成后，将细胞转移至1.5毫升离心管中，并加入400微升含有Rho激酶抑制剂的电穿孔缓冲液。室温下孵育30分钟使细胞恢复。接着，在500×g离心5分钟以收集细胞沉淀。

弃去上清液后，将细胞接种于 200 µL ECM 中。待凝固后，加入小鼠扩增培养基。进行类器官制备时，需在移植前约三天对人泪腺类器官进行传代。

为了从细胞外基质（ECM）中分离类器官，将dispase加入培养基中，使其终浓度达到每毫升0.125单位，并使用P1000移液器充分重悬ECM液滴以将其打散。将培养板放回37摄氏度培养箱中孵育30分钟。用10毫升基础培养基重悬类器官，以洗去酶。

在400×g离心5分钟后收集细胞，将其重悬于50 µL含有5% ECM的冷的人类扩增培养基中。将类器官悬液置于冰上，并立即进行移植。对于小鼠原位移植，用胰岛素针头吸取类器官悬液。

当小鼠处于睡眠状态时，迅速将其侧放，使主泪腺暴露以便操作。将五微升类器官悬液直接通过皮肤注射至泪腺内。让小鼠恢复，并每日评估是否存在与移植相关的不适症状，尤其是眼部情况。

在分离小鼠泪腺后，通过酶消化和机械消化获得包括腺泡和导管在内的小块组织。在成功建立小鼠泪腺类器官的过程中，约500微米直径的囊状类器官在7天后出现。人泪腺类器官在组织分离后3至4天内形成囊状结构，并在10至14天内达到成熟大小。

分别在分化培养基中培养五天和七天后，小鼠和人类泪腺类器官变得更为致密。加入环磷酸腺苷激活剂佛司可林或神经递质去甲肾上腺素后，类器官在不到三小时内出现肿胀。在成功的电穿孔实验中，能够耐受潮霉素的类器官得以生长。

在分化前挑选出直径大于300微米的类器官克隆。针对向导RNA靶向的Pax6位点进行PCR扩增，所有选中的克隆均产生一条367个碱基对的条带。使用靶向Pax6的向导RNA，从测序的六个克隆中获得了一个纯合敲除小鼠泪腺克隆。

一些克隆生长良好，但部分类器官克隆在挑取后丢失或开始发生分化。在挑取的10个类器官克隆中，有7个生长良好。通过染色人源特异性标志物——人核仁抗原，证实了在将类器官注射到小鼠泪腺一个月后，类器官成功移植。

需要注意的是，避免对组织或类器官过度消化，否则可能导致细胞死亡，从而降低类器官的建立效率。泪腺类器官可通过组织学方法进行分析。

通过这种方法，可以深入了解它们的细胞组成。