用于同步评估荧光生物传感器动态与激素分泌谱的人类伪胰岛系统

我们的实验室致力于了解、预防并逆转1型和2型糖尿病中的β细胞功能障碍及其他胰岛异常。我们的研究通过整合人类胰腺、胰岛生物学以及健康与疾病状态的研究，聚焦于人类糖尿病的发病机制。人类胰岛呈三维球形结构，对整个胰岛内所有细胞的获取存在一定的实验挑战，例如在尝试引入生物传感器以研究胰岛细胞信号传导时。

我们的类胰岛体实验方案通过在单细胞状态下进行基因操作，并将这些转导后的人胰岛细胞重聚集成类胰岛体，用于后续研究，从而克服了这一挑战。该类胰岛体系统使我们能够在整个胰岛中表达生物传感器，而不仅限于胰岛表面。结合我们的活细胞成像与微灌流系统，我们能够同时测量并共定位细胞内动态过程与下游激素分泌。

该方案可用于回答多种重要的科学问题。例如，可将基因沉默策略与本方法相结合，以全局或细胞特异性的方式研究目标基因对胰岛功能及相关信号通路的影响。首先，将显微灌流装置的管路连接至芯片支架。

用基础分泌刺激剂（如 2 毫摩尔葡萄糖）冲洗通道 5 分钟。吸除微芯片顶部和底部阀门处多余的液体。微芯片的上半部分可确保微孔的良好密封，而下半部分则含有附着玻璃盖玻片的微孔。

接下来，用 5 微升 DMEM 预润湿一个孔。用移液器沿外周孔边缘移动，润湿缝隙。拍摄从人胰腺原代胰岛分离培养的人源假胰岛的明场和暗场图像。

使用预先润湿的移液枪，从23微升培养基中收集30至32个伪胰岛，并缓慢将其加入微芯片孔的中心。确保移液枪头无残留附着的伪胰岛。使用加样枪头轻轻调整伪胰岛位置，使其位于孔中心，以获得最大的视野范围。

拍摄微芯片中拟胰岛的体视显微镜图像，以校正拟胰岛的损失。如果未将培养板中的全部拟胰岛加载至微芯片中，需相应调整胰岛当量的定量结果。将微芯片底部放入支架中。

然后，将微芯片盖板小心地放置在上方，绿色垫圈朝下。在固定微芯片位置的同时，合上夹持器以夹紧微芯片。将含有分泌刺激剂、泵和微芯片的夹持器转移至安装在共聚焦显微镜上的环境培养室中，并将流出管路从培养室引出，连接至组分收集器。

将缓冲液置于15毫升锥形管中，管盖上钻有孔洞以防止管路偏移，分离螺母和雌接头，然后将管路拧入除泡器中以防止管路扭曲。接着，将组分收集器设置为每两分钟旋转一次，然后根据洗涤步骤和实验组分的数量装入相应数量的收集管。启动泵，以每分钟100微升的速度输送基础葡萄糖培养基。

观察馏分收集器出口末端是否有液滴，以判断系统是否正常流过。如标有红色“X”的管中所示，系统流出量减少表明系统可能发生堵塞或泄漏。待培养基流动稳定后，旋转馏分收集器头部，使液体流入各收集管中，并启动馏分收集器。

收集前15个洗涤组分，使假胰岛达到平衡。确认培养基持续且准确地流过后，弃去洗涤液。在收集洗涤液的同时，设置显微镜以进行活细胞成像。

将物镜设置为UPlan氟化物20X，1X缩放，荧光通道设置为EGFP，发射波长设为510纳米，激光波长设为488，检测波长设为500至600纳米。将时间序列设置为在整个实验过程中每两秒获取一次图像，采样速度设为每像素2微秒。现在，确定视野中伪胰岛的底部位置，并将焦平面调整至该位置上方15微米处，此焦平面将在整个成像过程中使用。

洗涤完成后，当馏分收集器移动至第一份馏分时，按下成像软件上的“开始”按钮，并将流出液收集到1.5毫升离心管中。在适当时间，手动将管路从基础缓冲液切换至新的刺激缓冲液管路。将前10份收集物置于4摄氏度环境中，以防止激素降解，并通过检查每管流出液的体积持续监测系统流速。

实验完成后，切换回基础培养基，让泵运行五分钟以冲洗刺激缓冲液。停止泵的运行，并在除泡器和组分收集器处断开微芯片 holder 的管路。关闭环境箱的所有门，以维持温度。

将灌注液在 -80 摄氏度下保存，用于后续激素分析。小心打开微芯片支架，取下微芯片的上盖。在取出前，对微芯片中的假胰岛进行最后一次显微成像。

调整胰岛提取物的IEQ。使用移液器和显微镜，将类胰岛从孔中转移至1.5毫升离心管中。在显微镜辅助下，确保所有类胰岛均已收集完全。

用500微升PBS洗涤两次。每次洗涤后，在94 ×g条件下离心伪胰岛1分钟。吸除上清液后，加入200微升酸性乙醇，并在4摄氏度下过夜保存。

第二天，离心提取物，然后将45微升上清液分装到三个新管中。将管子在-80摄氏度下保存，用于激素含量分析。转导的人胰岛细胞随时间推移表现出再聚集现象，经过六天培养后形成完整的拟胰岛结构。

转导后48小时内，细胞开始表现出可见的cADDis荧光信号，培养结束时转导细胞中生物传感器表达水平较高。伪胰岛中α细胞的平均转导效率为60%，β细胞中为95%。活细胞成像与微灌流系统可同步采集转导细胞内cADDis荧光反映的cAMP动态变化及激素分泌情况。

暴露于2毫摩尔葡萄糖时，相对cADDis强度和胰岛素分泌均保持较低且稳定水平。当细胞暴露于20毫摩尔葡萄糖和IBMX时，细胞内cAMP浓度显著升高，同时伴随胰岛素和胰高血糖素的增加。

将伪胰岛暴露于2毫摩尔葡萄糖和肾上腺素后，细胞内cAMP浓度升高，并伴随胰高血糖素增加。