的 离体 脊髓刺激期间运动神经元全细胞膜片钳记录用脊髓切片制备

脊髓刺激可帮助患者在损伤后恢复运动功能。运动神经元是执行感觉运动行为的最终单元。研究运动神经元的电反应有助于理解脊髓运动调节的内在机制。

膜片钳是细胞电生理记录的金标准方法，具有极高的时空分辨率。因此，本研究描述了一种利用膜片钳技术在单细胞水平上同时记录多个神经元不同刺激特征及其细胞反应的方法。与脑组织的膜片钳记录相比，脊髓膜片钳更具挑战性，因为脊髓被椎管良好保护且体积微小。

因此，本方案提供了快速显微解剖脊髓以及严格保持冰冻状态以获得更佳细胞活性的技术细节。膜片钳技术能够独特地揭示突触传递机制，并通过脊髓刺激来理解动作电位及编码模式活动。在暴露麻醉大鼠心脏后，使用精细剪刀剪开右心房，并在一分钟内以每秒约2毫升的速度注入100毫升冷灌注液。

将大鼠置于俯卧位，在髂前上棘和胸椎弯曲转折点处切断脊柱。立即将分离的脊柱放入充氧的冰冻灌流液中，以冲洗残留的血液和脂肪组织。随后将分离的脊柱转移至解剖托盘中，背侧朝上，头端靠近操作者。

用50毫升持续充氧的冰冻切割液填充托盘。在解剖显微镜下，使用显微剪从头端开始剪断两侧的椎骨椎弓根。接下来，用显微剪沿背侧中线小心切断硬脑膜。

小心抬起脊髓的头端部分，切断神经根，保留约一毫米。脊髓从椎管分离后，用两枚昆虫针将腹侧朝上固定。修剪多余的神经根，保留约一毫米完整。

然后使用显微剪将腰膨大分离至六到七毫米的长度。解剖脊髓并分离腰膨大后，将腰膨大置于35度斜面上，背侧朝上，尾侧朝下。用吸水滤纸吸去组织表面多余的水分。

将熔化的琼脂糖凝胶小心倒入含有腰膨大的培养皿中。将培养皿置于冰水混合物中，以确保凝胶迅速冷却。将凝胶塑造成15 × 10 × 10毫米的立方体，并使用超级胶水将其固定在样本盘上。

将振动切片机的参数设置为：切片厚度350微米，切片速度0.14至0.16毫米每秒，振幅1毫米，振动频率85赫兹。接着，使用盖玻片镊子夹取一片切片，放入盛有持续充氧人工脑脊液的孵育槽中。首先，将制备好的脊髓切片置于记录槽内。

然后将显微操作系统的阳极置于背侧中线附近，阴极置于背根进入区附近，以准确定位脊髓刺激器。现在切换至60倍物镜，以识别一个健康的神经元，其表面应光滑明亮，无可见细胞核。略微降低红外光强度，打开荧光光源，并将光滤镜调整为宽波段紫外激发模式。

现在选择一个适当的 Fluoro-Gold 阳性运动神经元，逐渐降低电极直至接近该神经元。当移液管接触到其表面时，在尖端水平观察是否有微小的膜凹陷，并释放之前施加的正压。然后使用注射器向移液管施加负压，并等待软件界面上的电阻值上升至吉欧姆（gigaohms）。

将膜电位钳制在负70毫伏。按下放大器软件界面上的快速电容补偿按钮。然后施加短暂的负压以击穿细胞膜，并按下放大器软件界面上的慢速电容补偿按钮。

进行脊髓刺激，持续一到两秒，刺激强度保持在1至10毫安之间。通过逐步增加刺激强度，直至观察到首个动作电位，以此确定运动阈值。在电流钳模式下，于阈下水平附近施加持续五秒的去极化电流注入，以区分延迟放电与即时放电的运动神经元。

关闭脊髓刺激后，继续记录膜电位，以捕捉自发的动作电位发放。当脊髓刺激的幅度升高时，膜电位随之增加，并且每10到20次刺激脉冲就会触发一次动作电位。在脊髓刺激关闭后，神经元会在短时间内产生一系列自发的动作电位。

随后，静息膜电位恢复至负65毫伏。