用于评估结核病疫苗效力的微菌落形成单位检测法

测定菌落形成单位（CFU）对于评估免疫反应抗细菌效果是必要的。然而，该方法通量较低，在应用于结核分枝杆菌等病原菌时，会变得繁琐且成本高昂。当我们需要对大量处理样本进行检测时，这一局限性尤为显著。

该研究聚焦于结核病及结核病疫苗的评估，探讨针对结核分枝杆菌的疫苗的安全性、免疫原性和有效性。研究提出了一种优化方法——微小菌落形成单位法（micro CFU），用于在临床前研究中计数细菌菌落，以评估疫苗的有效性。

本方案旨在通过小液滴生成与常规培养皿相当的菌落形成单位（CFU）结果，从而优化CFU的测定。从如此小的样本中定量细菌活力，使我们能够利用传统方法所需材料和时间的一小部分，分析数千个数据点。我们的研究旨在解析抗原呈递机制，并鉴定出最相关的抗原以优化抗原呈递。

这将有助于我们设计和开发更有效的疫苗，以改进或取代目前的结核病疫苗（即卡介苗BCG）。首先，在BCG培养物的对数生长中期或后期收集菌体，然后在3000g离心10分钟。

然后弃去上清液。接着加入10毫升磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤细菌。离心后，弃去上清液。

将沉淀重悬于5毫升感染培养基中。将离心管置于超声波清洗仪中，以80赫兹频率、全功率超声处理15分钟。随后，在1000×g条件下离心10分钟。

收集上清液，弃去沉淀。测定上清液的光密度。

使用孔板进行连续稀释时，首先将分枝杆菌悬液加入96孔板的A行和E行各孔中。在其余各孔中加入180微升去离子水，用于后续的连续稀释步骤。使用12通道移液器重悬A行中的菌液，然后将20微升转移至B行。重复此重悬和转移操作，依次从B行至C行，直至D行为止，完成系列稀释。对于微滴涂布，使用0.5至10微升的多通道移液器配合细尖吸头，从96孔板每一行中各取5微升样品，转移至固体培养基方板上。

让液滴轻微接触琼脂表面，以确保正确转移并尽量减少吸头内部的液体残留。待液滴干燥后盖上培养皿。在37°C条件下孵育，同时监测细菌生长情况。

可选择将琼脂平板放入密封的塑料袋中，以防止干燥。培养 6 至 10 天后，检查是否有肉眼可见的单菌落。将平板置于倒置显微镜下，使用最低放大倍数的物镜进行观察。

或者，可使用相机拍摄液滴图像，并在计算机上使用 ImageJ 进行菌落的手动计数，以实现自动化的菌落计数。微菌落形成单位（micro-colony forming unit）或微 CFU 检测法可用于从少量琼脂平板中获得大量数据。利用脂质体递送沙奎那韦可提高针对具有不同耐药性的分枝杆菌菌株的治疗效果。

执行人工计数方法时，首先启动 Fiji 软件。打开包含微菌落形成单位的图像。导航至插件（Plugins），然后依次点击分析（Analyze）和细胞计数器（Cell Counter）。

在细胞计数器菜单中，通过点击“Initialize”初始化程序，并选择一个计数器。然后依次点击每个菌落。若误点击，请点击“Delete”撤销操作。

记录计数器上显示的数值。按下重置按钮以重新开始计数，并打开新图像以计数更多样本。对于自动计数，可在 Fiji 中通过选择“图像”，然后选择“类型”并点击“8 位”来将图像转换为 8 位灰度图像。

使用工具栏中的椭圆工具，在菌落周围绘制一个椭圆，必要时调整椭圆的大小和位置。然后选择“编辑”，接着选择“清除外部”以去除区域外的干扰。现在，选择“图像”，然后点击“调整”，选择“阈值”，调节阈值菜单中的滑块，直到菌落以红色显示且背景噪声最小。

单击“应用”并退出阈值窗口，生成一幅黑白图像。现在，选择“分析”，然后单击“分析颗粒”，并在“分析颗粒”窗口中设定菌落面积和圆度的范围。

在“显示”弹出菜单中选择“轮廓”，启用“显示结果”以获取详细测量数据，并勾选“清除结果”以删除任何先前的测量。点击“汇总”框，通过选择“确定”启动分析器，以显示测量结果的汇总信息。观察新窗口的出现，其中展示所有已检测并计数的菌落轮廓。

可在结果窗口中查看每个菌落的详细信息，并在汇总结果窗口中查看计数的菌落总数。