分离大鼠骨髓中性粒细胞的独到方法及其功能可比性

我们建立了一种从大鼠中分离中性粒细胞并随后提取中性粒细胞胞外诱捕网（NETs）的方法。该方法为在大鼠及大鼠源性细胞系中开展与NETs相关的实验提供了优化的可及性。在本研究中，我们比较了从大鼠外周血和骨髓中分离得到的中性粒细胞。

我们的研究结果突显了骨髓来源中性粒细胞的优越性，不仅在分离得到的中性粒细胞数量上具有显著优势，而且表现出良好的同步化能力。我们基于骨髓分离大鼠中性粒细胞及中性粒细胞胞外诱捕网（NETs）的方法通过优化此类细胞的分离技术，填补了该领域的研究空白。与以往主要采用外周血的方法不同，本方案靶向骨髓，可获得更高数量和更大产量的中性粒细胞，为研究中性粒细胞及NETs的生物学特性提供了更为准确的大鼠模型。

开始骨髓采集时，将已处死的大鼠浸泡于75%乙醇中，以消毒毛发和皮肤。将大鼠仰卧放置，并在髋部切断下肢，以保护股骨头。

使用解剖剪剪断鹰嘴关节处的韧带。然后将膝关节向后折叠，以暴露股骨和胫骨。使用镊子和剪刀。

仔细去除附着在骨骼上的肌肉、肌腱及其他组织。使用直径五毫米的针头注射器从骨两端穿刺，将骨髓推出，以松解骨髓基质。然后使用新的注射器，以10至15毫升RPMI培养基冲洗出骨髓。

将骨髓细胞在20摄氏度下以300 G离心10分钟。弃去上清液，并将细胞重悬于5至10毫升红细胞裂解缓冲液中。孵育悬液后，向混合物中加入四倍体积的HBSS。

然后在室温下以600 G离心细胞5分钟，使用所得沉淀物进行后续操作。首先使用大鼠骨髓中性粒细胞分离试剂盒分离中性粒细胞。在15毫升离心管中加入2毫升80%至55%的Per Coll试剂，形成密度梯度。

然后将分离得到的中性粒细胞或使用大鼠骨髓中性粒细胞分离试剂盒分离细胞后重悬于溶液中的细胞转移至离心管中。用无菌移液管混匀后，在20摄氏度下以800 G离心40分钟。收集70%密度梯度层，包括位于65%至70%界面处的细胞层。

将细胞悬液转移至一个新的15毫升离心管中。向管中加入15毫升HBSS，并轻轻颠倒混匀。最后，在室温下以300 ×g离心10分钟，使细胞沉淀，完成一步法操作。

将骨髓悬液直接用移液器加入密度梯度离心管中，按先前所示方法进行离心。接着，用移液器吸出70%梯度层，包括75%至70%梯度交界处的各层。将此细胞悬液转移至一个新的50毫升离心管中，并加入10毫升HBSS。

然后在室温下以400 G离心5分钟，使细胞沉淀。使用血细胞计数板对分离的中性粒细胞进行计数，并通过台盼蓝染色评估细胞活力。两步法的纯度达到90%，相较于一步法的50%有显著提高。

首先，在无菌的10厘米培养皿中，用4毫升添加了补剂的DAR PMI培养基重悬分离得到的大鼠中性粒细胞。接着，向中性粒细胞悬液中加入4微升PMA，以诱导NETs的形成。将混合物在37摄氏度、5%二氧化碳条件下孵育3小时。

作为阴性对照。向中性粒细胞悬液中加入四到五微升 DNase 1，以降解分泌的中性粒细胞胞外诱捕网（NETs）。然后加入四毫升 HBSS 洗涤 NETs。

每孔加入四毫升新鲜培养基冲洗，以解离 NETs。现在将洗脱液收集至新离心管中，并频繁使用移液器吹打，确保 NETs 完全重悬。在 20 摄氏度下以 300 G 离心 10 分钟，去除任何漂浮的细胞。

然后将含有 NETs 的上清液转移至新离心管中，离心收集 NETs 悬液及漂浮细胞。将细胞悬液接种于 24 孔板中，孔内预先放置直径为 1.4 厘米的玻璃盖玻片，以使漂浮细胞沉降。随后用 4% PFA 固定盖玻片上的细胞，并进一步验证 NETs 的存在。

接下来，将一滴 HBSS 滴加到覆盖有石蜡膜的试管架上。将盖玻片倒置浸入 HBSS 液滴中以进行洗涤。洗涤后，在室温下用 250 µL 的 0.5 × Triton X-100 孵育细胞 10 分钟，以使其通透化。

然后用HBSS洗涤细胞三次，每次一分钟。将细胞在室温下用10%正常驴血清封闭一小时。最后，在4°C条件下，加入70至90微升抗大鼠抗体，孵育过夜。

将盖玻片在 HBS 中洗涤 3 次，每次 5 分钟。随后将盖玻片在室温避光条件下用二抗孵育 1 小时，然后用 HBSS 洗涤。用 70 至 90 微升的 DAPI 染色细胞核和 NET 骨架。

用HBSS洗涤三次，每次五分钟。首先，将50微升分离的大鼠NET样品用移液器转移至含有450微升Tris EDTA缓冲液的离心管中。然后，将100微升DNA标准品和样品分别加入96孔板中。

向各孔中加入等体积的检测试剂。然后将酶标板在室温下孵育两到五分钟，避免暴露于直射光下。将酶标板放入荧光酶标仪中，设置发射波长约为530纳米，激发波长约为480纳米。

将细胞在1 µL细胞核染料中孵育30分钟。接着，将细胞在1 µL无细胞DNA染料中孵育10分钟。轻轻混匀荧光染料。

将样品板加载到流式细胞仪中，切换至Cytox Green通道，然后选择hexed通道。将照明设置为蓝色377/447，调整曝光时间为300,000微秒。

单击聚焦设置，然后点击自动注册。为自动调整焦点，请选择 OX 屏幕通道并将照明设置为绿色 483/536。将 cytox 屏幕的曝光时间设置为 30,000 微秒。

单击“开始扫描”以启动扫描过程。在外周血和骨髓中性粒细胞之间可观察到相似的NET分泌反应。无论是否经PMA刺激，大鼠中性粒细胞彼此之间的交联能力均有限。

与PMA孵育4小时后，无细胞DNA含量增加了10%，表明其更易诱导NET的形成。