生成具有不同唾液酸化表型的单核细胞来源树突状细胞

糖免疫学研究组的研究范围是探讨聚糖在人类健康与疾病中免疫学功能的作用。本研究旨在解析由糖基化介导的生物学机制，并发现基于聚糖的癌症及先天性糖基化障碍疾病的新疗法。我们的研究重点是唾液酸化聚糖，这类聚糖可影响关键细胞表面分子的功能，尤其在免疫应答过程中发挥重要作用。

我们开发了用于调控唾液酸含量的技术，以及一个高通量的多模式平台，用于开发具有潜在临床应用价值的糖结合蛋白。为了推动该领域的研究进展，我们采用了多种技术，包括糖组学分析、筛选或抗体染色、质谱分析和免疫组织化学，利用细胞系作为疾病模型进行体外实验，并通过酶工程和代谢工程手段调控唾液酸含量。当前实验面临的主要挑战在于解析唾液酸化聚糖与凝集素之间复杂的相互作用。

它们在多种免疫反应中具有机制性和功能性的后果。唾液酸可调节树突状细胞的活性以及MHC-I的转换。这一发现揭示了新的生物学和病理学机制，并推动了创新疗法的开发。

该研究还发现了新的免疫通路及其治疗性调控策略。在体外生产用于治疗用途的人源单核细胞来源树突状细胞时，一个关键问题在于这些细胞无法完全成熟。本方案表明，通过使用唾液酸酶对细胞表面进行酶处理，可在维持细胞活力的同时实现疾病的成熟。

该方法具有成本效益高和节省时间的优点。与唾液酸代谢抑制剂相比，神经氨酸酶处理提供了一种快速、有效且稳定的去除细胞表面唾液酸的方法，同时能够维持细胞活力。深入理解含唾液酸聚糖的作用，将前所未有地揭示这种聚糖在癌症中的重要性，并有助于发现新的疾病机制和新的治疗策略。

通过获取人血沉棕黄层，开始分离外周血单个核细胞，将七毫升转移至无菌的15毫升锥形管中。加入六毫升磷酸盐缓冲液进行初步洗涤。在室温下，使用带有摆动转子且关闭刹车的离心机，以1,100 ×g离心10分钟。

使用巴斯德移液管收集白细胞悬液，并转移至一个新的无菌15毫升锥形管中。向白细胞悬液中加入PBS溶液，直至总体积达到10毫升，然后通过上下吹打轻轻混匀。接下来，取3毫升密度梯度介质加入一个新的无菌15毫升锥形管中，以制备密度梯度溶液。

静置至室温。沿含有密度梯度介质的锥形管管壁缓慢加入5 mL稀释后的白细胞悬液，形成5:3的密度梯度分离。注意避免扰动介质。

使用带有摆动转子且刹车关闭的离心机，对密度梯度培养基中的悬液进行离心，以实现梯度分离。接下来，用巴斯德吸管小心地将最多25毫升的PBMC薄层转移至已装有PBS的新50毫升锥形管中，并充分混匀。为去除残留细胞和碎片，将样品在室温下以600 ×g 离心10分钟，使用正常刹车。

弃去上清液，并用 PBS 将样品补至 10 毫升。取一份等分试样用于细胞计数。为去除血小板，以正常刹车速度离心，然后小心倒置离心管以弃去上清液。

采用磁性激活细胞分选法进行单核细胞CD14+分离时，将细胞沉淀重悬于微珠缓冲液和CD14免疫磁性微珠中。在4摄氏度下孵育细胞悬液15分钟。为去除未结合的微珠，每1×10⁷个细胞加入一至二毫升微珠缓冲液，然后在室温下以600 ×g离心10分钟。随后，小心倒置离心管以弃去上清液。

使用前将LS柱置于磁铁上并进行准备。用3毫升微珠缓冲液冲洗，并立即每1×10⁸个细胞用500微升微珠缓冲液重悬细胞沉淀。将细胞悬液加入LS柱入口，并在柱出口下方的15毫升锥形管中收集阴性细胞组分。

用三毫升微珠缓冲液洗涤层析柱三次。最后一次洗涤后，将层析柱从磁铁上取下，置于一个无菌的15毫升锥形管上。用移液器将五毫升微珠缓冲液加入层析柱入口。

立即将装有目标细胞的注射器活塞插入柱入口，并将细胞注入柱中。随后，离心CD14-和CD14+细胞组分，并弃去上清液。为将单核细胞分化为人单核细胞来源的树突状细胞，通过向CD14+细胞中加入适量分化培养基，制备细胞密度为每毫升1.3 × 10⁶个细胞的细胞悬液。

用巴斯德移液管吹打重悬单核细胞。将每毫升含1.3 × 10⁶个细胞的悬液接种至24孔板的每个孔中，于37°C、含5% CO₂的培养箱中孵育。每两到三天更换一次培养基，并补充新鲜的细胞因子。

为收集已分化细胞，使用微量移液器将全部细胞悬液转移至无菌锥形管中，并用磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤培养瓶两次。将锥形管在室温下以180 ×g离心10分钟，随后将沉淀重悬于适合实验设计的培养基或缓冲液中。在单核细胞分化过程中，白细胞介素-4和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子的刺激改变了细胞表型。

数据显示，人单核细胞来源的树突状细胞失去了主要由单核细胞表达的表面标志物CD14，同时显著获得了人树突状细胞标志物CD1a的表达。人单核细胞来源的树突状细胞还表现出更高的MHC-II、HLA-DR表达水平，后者是人树突状细胞及其他抗原呈递细胞所表达的抗原呈递分子。从24孔板的10个孔中（每孔约含1.3×10⁶个细胞）收集约10×10⁶个人单核细胞来源的树突状细胞，这些细胞由单核细胞分化而来。

将它们转移至一个新的无菌15毫升锥形管中。在室温下以300 G离心5到7分钟（使用正常刹车），弃去上清液以去除死细胞和碎片。向管中加入10毫升含11.1毫摩尔/升葡萄糖的RPMI 1640培养基。

在室温下以300 G离心4分钟（使用常规刹车）后，再次弃去上清液。向细胞沉淀中加入2毫升RPMI 1640培养基，将1毫升细胞悬液均分至两个新的无菌微量离心管中，分别标记为1号和2号。向1号微量离心管中加入500毫单位来自产气荚膜梭菌的神经氨酸酶。

将两个试管在37摄氏度下孵育60分钟。孵育结束后，将两个微量离心管中的细胞转移至相应的新15毫升锥形管中，分别标记为1号和2号。然后，向每个锥形管中加入约4毫升含10% FBS的完全RPMI 1640培养基。

将离心管在室温下以300 G的离心力离心4分钟（使用常规刹车），然后向沉淀中加入5毫升完全RPMI 1640培养基。每孔接种1毫升细胞。通过流式细胞术和共聚焦显微镜评估唾液酸酶处理降低人单核细胞来源的树突状细胞表面唾液酸含量的效果。

唾液酸酶处理显著降低了紫藤刀豆凝集素和黑接骨木凝集素的结合，同时增强了花生凝集素染色。唾液酸酶处理后，黑接骨木凝集素染色的减少表明细胞表面的黑接骨木凝集素染色显著降低。通过在室温下以300 G离心5分钟并使用正常刹车洗涤细胞，开始收集用于抗体染色的新一批目标细胞样本。

将细胞分装至微量离心管中。使用所需抗体进行染色时，将荧光标记的抗体在室温下避光孵育15分钟。用一毫升磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤细胞，随后在室温下以300 ×g离心五分钟。

向所有微量离心管中加入最多 100 µL 的 PBS。然后将细胞重悬于 300 µL 的 2% 多聚甲醛中，并将离心管置于 4°C 避光保存，直至进行流式细胞术检测。由于唾液酸酶处理，抗原呈递分子 MHC-I 和 MHC-II 以及共刺激分子 CD80 和 CD86 的表达均显著增加。