肿瘤发生过程中抗原特异性CD8⁺ T细胞动态变化评估的引流淋巴结转移模型

本方案为研究淋巴结转移过程中抗原特异性CD8+T细胞提供了一个有效的生殖模型，该模型排除了旁观者CD8+T细胞的干扰。我们试图揭示抗原特异性CD8+T细胞在淋巴结转移期间的全身性与局部动态变化。近年来不断积累的证据表明，来源于外周的肿瘤特异性TD8+细胞，尤其是在肿瘤引流淋巴结中而非肿瘤微环境内，介导了免疫检查点阻断疗法的疗效。

近期，我们在小鼠肿瘤模型和人类肝细胞癌患者的肿瘤引流淋巴结中鉴定出TCF-1+TOX-肿瘤特异性记忆T细胞，这类细胞可作为免疫检查点阻断治疗的普遍响应者。由于通过其他技术手段检测淋巴结转移并不总是可行，因此难以准确评估干预的时间点。本方案提供了一种精确研究淋巴结转移过程中抗原特异性CD8+ T细胞免疫应答的方法，同时排除了旁观者CD8+ T细胞的干扰。

我们的实验设计提供了一个有用的模型，用于研究淋巴结转移过程中抗原特异性的CD8+ T细胞，以及这些抗原特异性CD8+ T细胞在淋巴结转移期间与其他免疫细胞或基质细胞之间的相互作用。我们将尝试阐明淋巴转移如何影响抗肿瘤免疫应答，特别是TdLN-TTSM细胞的特性与功能。这些结果将影响临床治疗中关于是否切除或保留MLN的决策，并为调控MLN以实现最大治疗效益提供新的思路。

首先，制备B16F10-GP黑色素瘤细胞悬液。在吸取细胞悬液前，轻弹试管壁以使气泡移至顶部。使用1 mL注射器吸取100 µL细胞悬液，并推动活塞排出顶部的气泡。

接下来，将小鼠保持仰卧位，暴露其腹部。用手指按压小鼠左侧后肢，充分暴露左侧腹股沟区域的皮肤。剃除小鼠左下腹部的毛发，并用含75%乙醇的棉球擦拭清洁。

然后，保持进针角度约为45度并略向上倾斜，将针头插入左大腿上部腹股沟区域皮下组织，深度为0.5至1 cm。轻柔地插入针头，同时将细胞缓慢注射到皮下组织中。

观察到少量团块，表明皮下区域形成了液体囊泡。注射后，扣上保护套管，将其丢弃至锐器盒中，并将小鼠放回笼内。进行过继转移时，需在肿瘤接种后六至八天检查荷瘤小鼠，此时肿瘤已可触及。

在移植前一天，腹腔注射 4 mg 环磷酰胺。在移植当天，使用 100-U 胰岛素注射器吸取 200 L 的 P14 细胞悬液。去除注射器中的气泡。

接下来，将小鼠放入笼子中，并用红外灯照射5到10分钟，以扩张尾静脉。然后使用小鼠固定器将小鼠固定。拉直尾巴，并用75%乙醇擦拭。

将针头与尾静脉平行插入，并轻轻回抽活塞。若无血液流入注射器，缓慢将细胞悬液推入静脉。注射完成后，迅速拔出针头。

用棉球轻轻按压注射部位，并将小鼠放回新的清洁笼具中。密切观察小鼠数分钟，注意有无不良反应。首先，触诊原发肿瘤，判断肿瘤直径是否约为5 mm。

进行肿瘤切除时，将小鼠置于生物安全柜中，并放置在覆盖有洁净吸水纸的解剖板上。使小鼠呈仰卧位，其纵轴与实验操作者平行。使用浸有聚维酮碘的棉球对小鼠腹部进行消毒。

接下来，使用无菌手术刀在荷瘤部位附近的皮肤上做一个切口。将无菌镊子的闭合尖端插入切口中，充分暴露肿瘤。切除肿瘤时，应尽可能保持包膜完整。

使用无菌剪刀小心轻柔地去除肿瘤周围的结缔组织。首先，用100单位胰岛素注射器吸取20 µL B16F10-GP黑色素瘤细胞悬液。去除注射器中的气泡。

接下来，在接受肿瘤切除手术的小鼠中，将细胞悬液注射至一个腹股沟淋巴结。从淋巴结的远端插入针头，并缓慢移动至淋巴结中心。观察到淋巴结明显肿胀，表明液体已准确注入。

在另一侧腹股沟淋巴结注射等体积的磷酸盐缓冲液（PBS）。使用3-0缝线缝合切口。用聚维酮碘对伤口周围皮肤进行消毒。

然后，将小鼠放入清洁的笼子中，并使用红外灯保持其体温。保持小鼠侧卧位，持续监测直至意识恢复。植入B16F10-GP细胞后，通过苏木精-伊红染色观察到淋巴结转移。

在早期，转移性淋巴结中肿瘤细胞部分占据，部分区域仍含有未受影响的淋巴细胞。至晚期，转移性淋巴结被肿瘤细胞完全填充，并伴有肿瘤血管生成。此外，外周血中抗原特异性CD8+ T细胞的频率在早期为2.81%，到晚期下降至1.48%。

有趣的是，尽管在非转移性淋巴结中CD8+T细胞的比例保持稳定，但在转移性淋巴结中，该比例在早期阶段短暂升高，而在晚期阶段则急剧下降。