将重组RCAS(A)逆转录病毒微量注射至鸡胚晶状体

本文所述的鸡胚晶状体显微注射RCAS逆转录病毒的方法，旨在作为研究晶状体发育过程中蛋白质原位功能与表达的工具。与其他方法（如转基因模型和离体培养）相比，RCAS复制型禽类逆转录病毒在鸡胚中表达外源蛋白具有高效、快速且可定制的优势。该方法可将基因转移靶向定位于增殖性晶状体纤维细胞，且无需使用启动子。

该方法在研究晶状体发育、分化、细胞间通讯以及疾病进展方面具有显著潜力，并可用于进一步发现和验证白内障等晶状体病理状况的治疗靶点。首先，将硼硅酸盐玻璃毛细管固定到手动垂直式微电极拉制仪的橡胶缓冲夹具中。将微电极拉制仪的加热温度设置为950摄氏度，进行预拉制，以获得更细且更柔软的玻璃毛细管。

然后将加热温度设置为790摄氏度，进行二次拉制以制备最终的微电极。使用微电极磨针仪，小心地将尖端开口研磨至外径为11微米。随后将微电极置于玻璃瓶内的海绵夹持垫中。

将受精的鸡卵置于37°C、湿度适宜的摇动培养箱中孵育至发育第18阶段。用70%乙醇彻底擦拭工作区域。发育完成后，从培养箱中取出鸡卵。

用70%乙醇喷洒鸡蛋，然后让其自然晾干。接着将鸡蛋放置在蛋托上，较大的一端朝上。使用一把锋利的齿状镊子，轻轻敲击蛋壳较大的一端，打出一个直径约2厘米的孔。

然后去除卵壳碎片。将卵置于解剖显微镜载物台上，找到胚胎。接着使用精细解剖镊和剪刀剪除覆盖在胚胎顶部的羊膜。

然后将一个60毫米的培养皿盖在卵的开口上。首先，将RCAS(A)逆转录病毒储备液置于冰上解冻。为避免堵塞微量移液器，将溶液在4°C下以10,000 G离心10秒，并在保持溶液处于冰上的条件下，将上清液转移至新管中。

将拉伸的实验室用Parafilm置于35 mm × 10 mm的细胞培养皿上，并在Parafilm上加入1 µL无菌PBS。将制备好的玻璃微量移液管连接至自动皮升注射仪。按下“填充模式”将PBS吸入微量移液管，然后按下“注射模式”以测试分配出的1 µL液体。

将另一片拉伸的实验室用帕拉膜放置于新的细胞培养皿上，并在膜上加入一微升经快绿染色的病毒原液。将微量移液器的吸头插入病毒原液中，按下填充模式，使移液器吸入一微升病毒原液。在解剖显微镜下，将连接自动注射仪的已充液微量移液器对准鸡胚晶状体的目标区域并缓慢下降。

然后调整光源，以清晰观察晶状体泡。确保微移液管位于晶状体腔内的正确位置后，注入5至40纳升的病毒原液。注射后，等待45秒，再轻轻取出微移液管。

接下来，通过检查晶状体空腔内是否存在泄漏的快绿染料，确认显微注射是否成功。检查后，用透明胶带封闭蛋壳上的开口，并将鸡蛋置于37摄氏度的恒温湿润静止培养箱中。本研究通过免疫荧光技术，展示了嵌合型连接蛋白50和43环的组织学评估结果。

利用抗flag标签标记，将外源性连接蛋白与内源性连接蛋白区分开来。该研究还评估了连接蛋白50的胞内环结构域与水通道蛋白零之间的相互作用。