人外周血单个核细胞的冷冻保存与生物能量学评估

通过该方法，我们旨在描述一种适用于冻存外周血单个核细胞（PBMCs）的实验流程，使其在解冻后生物能量学参数保持不变。细胞冻存的主要实验挑战之一在于，冻融过程可能对PBMCs造成损伤，从而影响后续的生物能量学检测结果。本实验方案致力于提供一种可靠保存PBMCs的方法，避免细胞受损，从而确保所测得的生物能量学参数不受干扰。

保存PBMCs的可能性使得样本可以从不同中心收集，并在同一个地点进行检测。这还使检测在时间上更具独立性。PBMCs的冷冻保存使得在多个采集并保存细胞的地点可同时开展研究。

随后可对收集的样本进行集中检测。这可以简化研究的流程与规划。首先，向无菌的50毫升锥形管中加入8毫升DPBS。

向其中加入 8 mL 血液，并使用一支 3 mL 塑料巴斯德吸管充分混匀内容物。在另一支锥形管中加入 15 mL 淋巴细胞分离液，将管子倾斜 20 至 30 度。

然后，使用一支三毫升的巴斯德吸管，将血液与DPBS混合液轻轻加至分离介质上方，形成第一层。将剩余混合液沿离心管管壁小心地叠加上去。缓慢将离心管竖直，使剩余血液叠加在已形成的血液层上。

将离心管置于水平转子中，于室温下以 1,000 G 离心 10 分钟，离心时关闭刹车。血液/外周血单个核细胞混合物将分为四层。用巴斯德吸管移除上层血浆的 2/3，然后用 1 毫升移液器收集外周血单个核细胞（PBMCs）。

将PBMCs转移至一个新的50毫升离心管中，直至收集完整个细胞层。随后，用DPBS补足体积至25毫升，以去除残留的分离液及其他杂质。在室温下，以100 ×g离心10分钟，离心时开启刹车。

然后，用真空泵吸去上清液。接着，用一毫升 DPBS 重悬沉淀，并加入更多 DPBS 至总体积为 25 毫升，以洗涤并重悬沉淀。将冻存容器冷却至 4 摄氏度。

然后，将胎牛血清置于冰上。用一毫升胎牛血清重悬含有分离出的外周血单个核细胞的细胞沉淀。接着，按1:5的比例在冰上将DMSO与冷却的血清混合。

使用每个收集管对应一支标记好的2毫升冻存管，将细胞悬液转移至冻存管中。使用自动细胞计数仪测定细胞数量和细胞活力。用1毫升移液器向管中加入1毫升DMSO/FBS混合液。

然后，将试管放入预冷的冻存盒中，将冻存盒置于零下80摄氏度的冰箱中冷冻24小时。次日，从冰箱中取出试管，储存于液氮的气相中。

细胞计数和活力在冻存前后保持一致，表明分离和保存成功。