优化从新鲜及冷冻实体瘤标本中分离细胞核以进行多组学测序
2023年10月13日
本方案提供了一种可靠且经过优化的方法，用于从实体瘤样本中分离细胞核，以进行基于10x Genomics平台的多组学测序，内容包括组织解离条件、单细胞悬液的冷冻保存以及分离细胞核质量评估的建议。
随着我们对肿瘤生物学的认识不断深入，人们越来越关注了解肿瘤内细胞间相互作用的复杂性如何影响患者的预后。分析肿瘤微环境中不同细胞类型的重要性也随之增加。多组学测序技术能够以配对细胞的方式从同一个细胞中同时获取单细胞RNA测序和染色质可及性测序数据，为实现这一目标提供了重要进展。
然而，这些实验所获得数据的质量在很大程度上取决于实验条件和输入生物材料的质量。本方案提供了一种可靠且经过优化的方法，用于从实体瘤样本中分离细胞核，以利用10X Genomics平台进行多组学测序。该方案适用于新鲜或冷冻的单细胞悬液，均具有良好的可靠性。
我们提供了组织解离条件、单细胞悬液的冷冻保存以及分离细胞核评估的建议。在本方案中，我们使用人胰腺导管腺癌样本，这是本实验室重点研究的一种主要组织类型。胰腺癌代表了一类高度纤维化的肿瘤类型，其组织及细胞相对较为黏稠。
此外，由于可用于研究的胰腺肿瘤样本通常体积较小，因此需尽量最大化捕获的细胞数量。首先将先前解冻的胰腺肿瘤细胞悬液转移至一个2 mL微量离心管中，并加入PBS，使最终体积达到2 mL。然后使用血细胞计数板评估细胞的数量和质量。
通过离心获得细胞沉淀后，使用逐渐减小的移液枪头小心弃去上清液，以尽量减少沉淀的扰动，同时最大限度地去除液体。先准备好1倍浓度的细胞裂解缓冲液，然后取100微升加入到900微升预先配制的细胞裂解稀释缓冲液中，得到0.1倍浓度的细胞裂解缓冲液。将100微升预冷的0.1X细胞裂解缓冲液加入细胞沉淀中，轻轻吹打5次，以确保细胞完全重悬。
冰上孵育三分钟后，向重悬的沉淀中加入一毫升预冷的洗涤缓冲液，轻轻吹打五次。离心后，弃去上清液（如图所示），重复此洗涤步骤再两次。将台盼蓝染色的悬液加入血细胞计数板，对细胞核数量进行计数。
根据目标核回收量，将核沉淀重悬于1×核缓冲液中。用40微米移液器吸头细胞滤筛小心过滤重悬的核，然后置于冰上保存。现在重新计数核数量。
采用该方法获得的细胞核具有适当的大小和形态。偶尔可观察到核膜出现轻度点状斑驳，在通过血细胞计数板进行最终细胞核评估时应予以注意。
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概述
本方案概述了一种利用 10x Genomics 平台从实体瘤标本中分离细胞核以进行多组学测序的可靠且优化的方法。其中包括组织解离条件及单细胞悬液冷冻保存的建议。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 肿瘤学
- 基因组学
背景
- 了解肿瘤生物学对于改善患者预后至关重要。
- 分析肿瘤微环境中异质性细胞的重要性日益凸显。
- 多组学测序可实现单细胞RNA测序与ATAC测序的配对获取。
- 数据质量高度依赖于实验条件和生物样本的特性。
研究目的
- 提供一种从实体瘤中分离细胞核的可靠方案。
- 提高多组学测序数据的质量。
- 促进对肿瘤微环境的分析。
使用的方法
- 从实体瘤标本中分离细胞核。
- 使用新鲜或冻存的单细胞悬液。
- 组织解离条件的建议。
- 单细胞悬液的冷冻保存技术。
主要结果
- 建立了优化的细胞核分离方法。
- 从新鲜和冷冻样本中均获得了可靠的结果。
- 提高了多组学测序的数据质量。
- 提供了组织处理和冷冻保存的指导方案。
结论
- 该方案提高了从肿瘤中分离细胞核的可靠性。
- 它有助于推动多组学测序技术的发展。
- 未来的研究可受益于优化的实验条件。
常见问题
行业重要性概述
优化实体瘤样本中细胞核的分离对于生成高质量的多组学测序数据至关重要，直接影响转化肿瘤学中肿瘤异质性分析的可靠性。本方案解决了从新鲜及冷冻的纤维化肿瘤组织中提取完整细胞核的技术难题，支持稳健的单细胞多组学分析。在此阶段获得可靠的细胞核制备样本，可显著提升下游发现及生物标志物开发流程的预测可信度。
生物制药研发中的战略应用
早期发现与靶点验证
- 能够在单细胞水平上高保真地解析肿瘤细胞的异质性。
- 在分离过程中保留多种细胞群体，支持功能靶点的有效验证。
- 通过准确呈现肿瘤微环境，有助于开展机制性风险评估。
筛选与检测方法开发
- 为可重复的多组学测序实验提供标准化的细胞核制备。
- 确保下游工作流程中起始材料在定量和定性上的一致性。
- 通过兼容新鲜及冻存肿瘤样本，提高实验的准备就绪程度。
转化与临床前研究
- 通过实现RNA与染色质可及性的配对分析，契合转化生物标志物发现的需求。
- 通过捕获实体瘤微环境的复杂性，保持疾病的生物学相关性。
- 通过标准化输入样本质量，支持从发现到临床前验证的连续性研究。
流程与工作流整合
该细胞核分离方案位于组织处理与多组学数据生成的交汇点，连接了早期发现研究与转化研究的工作流程。
- 发现生物学：通过保持细胞多样性和完整性，最大化假设检验能力。
- 筛选：提供可重复、高质量的细胞核，用于可扩展的多组学测序分析。
- 分析：实现强大的定量读出，用于比较肿瘤细胞状态和染色质景观。
- 转化研究：支持配对的单细胞RNA和ATAC-seq分析，促进生物标志物的整合与对齐。
- 企业级复用：为多种实体瘤类型和样本条件建立标准化且可适应的实验流程。
运营与企业影响
- 科学价值：提高肿瘤生物学和靶点验证研究的预测可信度。
- 操作价值：增强对新鲜和冷冻肿瘤样本的可重复性与可扩展性。
- 战略价值：降低样本制备阶段数据丢失或引入人为假象的风险。
- 项目组合影响：支持经风险调整的肿瘤学发现与转化研究项目的推进。
实施注意事项
- 需要具备组织解离和细胞核处理方面的专业知识，以获得最佳的产量和质量。
- 需要获取专用试剂、细胞筛网以及定量评估工具。
- 为确保可重复性，需在不同团队间对消化和裂解条件进行标准化。
- 必须根据不同肿瘤类型和样本大小进行调整，特别是对于富含间质的组织。
- 必须密切监测细胞核完整性，以避免下游测序产生人为假象。
