人体阴道组织处理及原代成纤维细胞的分离

主要影响女性群体的疾病研究长期存在研究不足和资金匮乏的问题。盆腔器官脱垂是一种与女性性别密切相关的疾病，当盆底肌肉和韧带变弱时，盆腔器官会下移至骨盆更低的位置，导致阴道内出现膨出。

关于这种病理生理背景下细胞间的相互作用，以及组织水平因素如何影响外科干预的成功率，目前知之甚少。从人阴道组织中分离原代成纤维细胞可能有助于研究盆腔器官脱垂的潜在生物学机制。盆腔器官脱垂常见于老年或绝经后个体。

分离和扩增原代成纤维细胞的研究因老年供体的细胞数量减少以及克隆形成能力下降而具有挑战性。大多数使用人阴道组织样本的研究采用的是患有盆腔器官脱垂的育龄前个体的组织。尽管有少数文献报道使用了育龄前和绝经后个体的样本，但并未详细描述成功从老年或绝经后供体中分离成纤维细胞所采用的具体方案。

使用绝经后组织来源的成纤维细胞进行分离和疾病建模，对于理解盆腔器官脱垂的细胞病理生理学可能至关重要，因为该疾病在绝经后十年内的个体中患病率最高。本文描述了一种通过机械和酶解消化相结合的方法，从人阴道组织中分离并培养富含成纤维细胞的单细胞悬液的技术。本研究提供了一种可靠的方案，用于获取绝经后或衰老的人阴道成纤维细胞。所获取的组织样本通过组织学分析以验证该方案的有效性。

测量并切割组织，使其大小约为1厘米×1厘米。确保精确测量活检组织的尺寸。从同一供体准备另外两至三个阴道活检组织，每个大小均为1厘米×1厘米，并将这些活检组织妥善放置备用。

将阴道活检组织置于细胞培养用培养皿中后，使用两把无菌手术刀将阴道组织切成小块。确保刀片尖端与组织表面垂直。用两把手术刀对组织表面施加均匀且稳定的压力。

采用交替拉扯的方式将组织切割成非常细小的碎片。使用两把手术刀重复此切碎技术，直至样品成为大小均匀、直径为一到二毫米的碎块。向培养皿中加入二到三毫升无血清细胞培养基，悬浮切碎的组织。

用移液器将含有组织碎片的溶液上下吹打，以分散任何团块。将含有组织碎片的溶液转移至15毫升锥形管中。加入额外的无血清细胞培养基，直至总体积达到10毫升。

将Liberase储存为230微升的分装样品以备使用。向离心管中加入230微升Liberace。使用样品混合器，在37摄氏度下剧烈振荡孵育试管3小时。

保持持续振荡。孵育期间每30分钟涡旋振荡试管一次。在3000 ×g条件下离心样品5分钟。弃去上清液并丢弃。

用含有10%胎牛血清的一至二毫升细胞培养基重悬沉淀，以稀释Liberase。用力吹打直至沉淀完全重悬。通过轻轻吹打溶液使其过细胞筛，过滤组织酶解液。

将同一供体的多个组织活检样本的细胞悬液汇集在一起。用无菌5毫升注射器的活塞，将组织酶悬液经滤网推压过滤。重复此步骤，直至残留的组织碎片几乎全部被压过滤网。

将同一供体的多个阴道活检样本的细胞悬液接种于一个培养皿中。在37摄氏度下过夜培养后，使用相差显微镜观察细胞。确保显微镜聚焦于培养皿底部。

仅有少量成纤维细胞会贴壁于底部。以下是该实验方案的示意图，突出显示关键步骤。图二展示了第零天悬浮细胞的相差显微图像。

图三是在培养第14天以100倍放大倍数拍摄的阴道原代成纤维细胞的相差显微图像，组织样本来源于三个面积为1平方厘米的活检组织的悬浮液。表一显示了在本研究中尝试使用其他方案分离阴道成纤维细胞的结果。成纤维细胞通过波形蛋白（vimentin）阳性染色进行鉴定。

对绝经前和绝经后的阴道组织进行了免疫荧光分析，结果如图所示。图像在200倍放大倍数下拍摄。还对绝经前和绝经后组织样本中的分离成纤维细胞进行了α-平滑肌肌动蛋白和F-肌动蛋白染色。

我们建立了一种优化且可靠的从老年供体阴道黏膜中分离原代成纤维细胞的实验方案。在本研究中，使用既往发表的用于动物和人体组织的原代细胞分离方案，均未能从人阴道样本中成功提取任何成纤维细胞。我们推测，从人阴道组织中进行细胞分离存在困难可能有两个原因。

老年供体的黏膜真皮层厚度较大，且与非黏膜组织相比，老年个体中的成纤维细胞密度可能显著降低。某些关键步骤不应修改，包括采用双手术刀技术进行极为严格的机械消化，以及合并来自同一供体三至四个全层活检样本的细胞悬液。

我们的方案具有明显优势。机械和酶消化法可提高绝经后组织的得率，但对绝经前样本无负面影响。我们承认本方案存在若干局限性。

在未进行阴道脱垂手术的情况下，获取人阴道组织可能具有挑战性，且需要从多个组织活检样本中制备细胞悬液的方法也可能存在局限性。本方案提供了一种获取人阴道成纤维细胞的方法，将为未来盆底功能障碍的研究，尤其是绝经后个体的相关研究，提供有用的工具，同时也将为女性健康研究增添重要手段。