杂交链式反应RNA整体荧光原位杂交检测蚊虫嗅觉附器中化学感受基因

我们课题组致力于研究蚊子的化学感受系统。我们希望通过对蚊子的味觉和嗅觉进行靶向干预，阻止其寻找并叮咬人类。杂交链式反应荧光原位杂交技术是一项近期发展起来的方法。

该技术具有高灵敏度、高稳定性，并能够对多个基因靶标进行多重检测，从而可以在其天然环境中同时可视化这些基因的表达和定位。空间转录组学是空间生物学领域中使用的一种前沿方法。该技术能够对数千个基因进行多重检测，并可同时可视化这些基因的表达情况。

本实验方案使我们能够直接观察天线中哪些神经元表达了50种左右可能的离子型受体中的任意一种。这为我们提供了基础图谱，以指导我们理解这类因子受体如何介导行为。昆虫嗅觉器官（如天线）内的嗅觉神经元通常埋藏在一层保护性的几丁质外壳内部。

这使得在这些神经元中可视化嗅觉受体的表达变得非常困难。我们的方案结合了甲壳素酶处理和先进的荧光原位杂交技术，以克服这些挑战。首先，将解剖得到的按蚊头部置于预热的CCD缓冲液中，在37摄氏度的加热块上孵育5分钟。

将装有蚊虫头部的离心管转移至杂交炉中，在37摄氏度下旋转孵育。随后，将离心管中的全部内容物转移至解剖用表面皿中。使用镊子夹取头部或任何脱落的触角，并将其固定于1毫升预固定液中。

在振荡器中，将头部样本在预固定液中于 4 摄氏度条件下旋转孵育 24 小时。进行组织解剖时，首先在冰上用 1 毫升 0.1% PBS 吐温溶液冲洗头部样本，然后将头部转移至解剖用表面皿中。

在解剖显微镜下，用尖头镊子从头部去除目标组织。用镊子夹住头部的前部，并用另一把镊子从基部夹住一根触角。以同样方法去除须部，将触角和须部转移到置于冰上的空的无RNase的DNRNase-free管中。

在室温下用 400 微升脱水试剂对组织进行脱水处理，持续一小时。然后将脱水试剂替换为 400 微升无水甲醇，并在 -20 摄氏度条件下过夜脱水。固定完成后，在冰上用梯度复水溶液分四个步骤进行复水，每步 10 分钟。

然后在400 µL PBST中于室温下洗涤组织10分钟。将组织在400 µL蛋白酶K溶液中于室温下孵育30分钟。用400 µL PBST洗涤组织两次，以终止酶消化反应。

加入后固定液后，在探针杂交前用PBST再次洗涤组织。将组织浸入400微升探针杂交缓冲液中，孵育5分钟。接着，吸去缓冲液，并将组织在400微升预热的探针杂交缓冲液中于37摄氏度预杂交30分钟。

将预热的探针杂交缓冲液替换为400微升加热的探针溶液。将试管置于37摄氏度的摇床上孵育两晚。然后将摇床放入一个盒子里的培养箱中。

接下来，将组织在 400 µL 探针洗涤缓冲液中于 37 °C 摇床上孵育。在 SSCT 缓冲液中洗涤组织五次后，于室温下在 400 µL 扩增缓冲液中孵育 10 分钟。用移液器将扩增缓冲液从离心管中吸出。

然后加入加热后的发夹探针 H1 和 H2 的混合物。接着，用移液器加入 100 µL 扩增缓冲液。将组织在室温避光条件下旋转孵育过夜。进行组织封片时，首先在玻璃载片上滴加五滴封片液。

接下来，用镊子夹住已清洗的组织样本的基部，轻轻浸入一系列封片液液滴中进行冲洗。然后用封片液封片，并在组织上覆盖盖玻片。

成像前用指甲油封固盖玻片。对雌性按蚊嗅觉组织进行 HCR-FISH 分析发现，IR41t.1、IR75d 和 IR7t 在触角中的丰度较低。

IR64a 的丰度是其他候选基因的三倍。在蚊子的触角以及下颚须中均观察到 Orco 与 IR25a 受体家族的共定位。共定位模式表明，IR76b 阳性细胞表达 IR25a，而 IR8a 阳性细胞则与 IR76b 和 IR25a 部分共定位。