建立和表征源自良性胃体与胃窦上皮活检组织的患者来源胃类器官

我们的研究聚焦于胃癌的遗传病因。特别是，我们关注由 CDH1 或 CTNNA1 基因致病变异引起的遗传性弥漫性胃癌。我们还研究 BRCA1 和 BRCA2 在胃癌风险及癌变过程中的作用。

类器官正越来越多地应用于各种研究领域，胃肠病学也不例外。因此，迫切需要对这些类器官（特别是患者来源的胃类器官）的培养技术进行标准化。本方案提供了一种逐步操作的方法，可从胃窦和胃体区域的活检组织中可靠地培养出患者来源的胃类器官。特别是，我们采用单细胞消化法，以实现细胞接种的标准化，从而便于对来自不同患者的类器官进行可靠的比较分析。

我们的研究结果表明，与来自胃体区域的患者源性胃类器官相比，来自胃窦区域的类器官在初次接种后的20天内数量更多、体积更大。研究人员在利用来自胃部不同区域的胃类器官时应考虑这一发现。为了开始从患者上消化道内镜检查期间采集的胃活检组织中分离单个细胞，首先让组织在15毫升锥形管底部沉降。

待组织沉降后，使用移液器吸除培养基，并用一毫升含抗生素的 PBS 洗涤组织样本两次。取至少 20 毫克组织转移至含有 1 毫升添加了 DTT 的 PBS 的 1.5 毫升离心管中。使用精细解剖剪将组织剪成 1 至 2 毫米或更小的碎片。

使用台式小型离心机离心15秒，使组织块聚集于管底，然后尽可能吸除上清液。向一个50毫升锥形管中加入5毫升新鲜预热的消化缓冲液。从此管中转移500微升缓冲液至含有组织块的1.5毫升管中。

接下来，使用剪刀从底部剪去1,000微升移液器吸头的尖端，以增大吸头口径，减少组织损失。现在，用改造后的移液器吸头将小块组织从1.5毫升离心管转移至50毫升离心管中的消化缓冲液中。将消化缓冲液与组织混合物在37摄氏度下孵育30分钟，同时以200转/分钟的速度进行振荡。

然后，向消化缓冲液中的组织加入5毫升预热的含0.25%EDTA的胰蛋白酶，并进行孵育。加入等体积的高级DMEM/F-12培养基以中和消化缓冲液和胰蛋白酶，将悬液通过70微米细胞筛网过滤。首先，将已解冻的基底膜基质从冰上取出。

将计算好的基底膜基质体积加入来自胃活检的单细胞中，通过上下吹打约10秒轻轻混匀。然后使用移液器迅速将50 µL基质与细胞混合物分装至24孔组织培养板各个孔的中央。立即盖上培养板，并以单一平稳动作将培养板倒置。

将倒置的培养板放入37摄氏度的组织培养箱中孵育35分钟，以使基底膜基质聚合。随后，向每个孔中加入500 µL预热的胃类器官培养基，确保每个类器官穹顶的顶部完全浸没在培养基中。通常在单细胞接种后10天内即可观察到类器官的形成。

到第20天时，类器官体积较大，通常需要进行传代。类器官在接种后第10天数量达到峰值，随后有所减少，但差异不显著。来源于胃窦活检组织的类器官比来源于胃体活检组织的类器官具有更高的生长速率。

不同患者来源的类器官在单个基质胶滴中通常表现出形态学上的多样性。然而，总体而言，类器官的球形度变异较小。当患者来源的胃类器官生长至可传代状态时，即可开始进行常规传代操作。

首先，从24孔板中每个含有包埋于基底膜基质中的类器官的孔中移除培养基。然后，直接将1毫升冰上预冷的高级DMEM/F-12培养基加入基底膜基质圆顶上。重复进行吸除和添加培养基的操作，直至基质圆顶的所有碎片均从孔板上脱落。

然后，将培养基和碎片化的基底膜基质从一个孔转移至下一个孔，并对所有需要传代的孔重复此操作。在拆解最后一个基底膜基质小滴后，将培养基和混合物收集至一个 1.5 毫升离心管中。将 1,000 微升枪头安装到 P1000 移液器上，然后将该枪头插入一个 200 微升枪头中。

使用此移液器装置，剧烈地将类器官基质混合物上下吹打约25次，以将类器官破碎成小片段。将破碎后的类器官混合物置于台式离心机中，在4°C、2,000g条件下离心30秒。使用移液器吸除培养基和基底膜基质上清液。

将计算好的新鲜基底膜基质体积加入到管中已离心的类器官中。轻轻吹打管内液体，充分混匀。迅速将50微升类器官基质混合物分装至24孔板的各个孔中。

立即盖上培养板，并以单一平稳动作将培养板翻转至倒置状态。将倒置的培养板放入37°C组织培养孵育箱中孵育35分钟，使基底膜基质聚合。最后，向每孔加入500 µL预热的胃类器官培养基。

在起始培养后的第20天，类器官已准备进行传代，表现为类器官体积较大或内部变暗。若继续培养超过此阶段，类器官将开始分解为二维单层细胞。在对胃类器官进行传代和重新接种后，培养皿中出现大量类器官碎片，这些碎片迅速自我重组，形成更多新的类器官。