快速定量测定谷胱甘肽氧化态与还原态的方法 正交 -在体外培养的哺乳动物细胞中使用邻苯二甲醛
2024年6月28日
通过使用邻苯二甲醛（Ortho-phthalaldehyde, OPA）可实现对谷胱甘肽的氧化型与还原型（分别为GSSG和GSH）的定量检测。OPA与GSH结合后会发出强烈荧光，但无法与GSSG结合，除非先将GSSG还原。本文介绍了一种多参数检测方法，利用蛋白质定量进行归一化，以同时定量检测这两种形式。
我们旨在提供一种定量测定硫醇浓度的新方法，特别关注可在原位进行的不同细胞系中GSH和GSSG浓度的检测。我们认为该方案对科学界具有实用价值。目前已有大量研究致力于检测活性氧相关的特定生物标志物。
此外，许多研究者对检测短寿命的活性氧物种表现出浓厚兴趣，例如自由基以及羟基和单线态氧等小分子。对于多个研究机构而言，一个关键挑战在于能否在无需昂贵设备或繁琐流程的情况下，准确且特异性地检测目标生物标志物。本实验方案支持多参数分析，可在无需单独进行其他实验步骤的情况下实现数据的标准化。
并去除其他检测方法中存在的多个步骤，这些步骤通常耗时较长、试剂不兼容或使用对健康有害的试剂。纳米材料安全小组将继续评估各类纳米材料和聚合物对人类健康可能产生的影响。我们认为本方案是实现这一目标的重要工具之一，因为该方案有望通过多重检测来识别更多的生物标志物。
首先，准备好进行检测所需的所有材料。对于谷胱甘肽（GSH）标准品，向每个孔中加入40 µL总谷胱甘肽缓冲液。接着，从含有细胞沉淀的培养板各孔中吸去培养基，并用预冷的PBS洗涤细胞三次。
使用10微升谷胱甘肽和双蒸水作为空白对照，设置三份平行样制备标准曲线。为实现目标定量，将洗涤后的细胞与适当混合液在300 RPM的摇床中孵育2分钟。然后向每孔加入5微升0.01摩尔的Tris(2-羧乙基)膦溶液，并再次孵育10分钟。
接下来，将培养板在200 G条件下离心5分钟。然后从每个样品孔中转移25微升至一个新的透明96孔板中，用于蛋白质定量。随后，向每个含有30微升样品的孔中加入170微升工作浓度的邻苯二甲醛溶液。
为防止光线照射，用铝箔完全覆盖培养板，并在轨道摇床中孵育15分钟。最后，使用酶标仪在340纳米激发波长和450纳米发射波长下读取荧光信号。在此检测中，经不同纳米材料处理的A-549细胞显示出不同的谷胱甘肽二硫化物比率。
而用每毫升125微克银处理的细胞表现出最高值。
概述
本研究提出了一种定量测定多种细胞系中还原型（GSH）和氧化型（GSSG）谷胱甘肽浓度的新方案。该方法利用邻苯二甲醛（OPA）进行荧光检测，可在无需复杂操作步骤的情况下实现数据的高效归一化。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 生物化学
- 细胞生物学
背景
- 活性氧是多种生物过程中的重要生物标志物。
- 准确检测谷胱甘肽（GSH）和氧化型谷胱甘肽（GSSG）对于理解氧化应激至关重要。
- 现有方法可能成本较高且耗时较长。
- 本实验方案旨在简化定量检测流程。
研究目的
- 提供一种可靠的谷胱甘肽（GSH）和氧化型谷胱甘肽（GSSG）浓度定量方法。
- 促进在不同细胞系中的原位分析。
- 降低现有检测方法的复杂性和所需时间。
使用的方法
- 制备谷胱甘肽标准品及校准范围。
- 用特定试剂洗涤并孵育细胞沉淀。
- 使用邻苯二甲醛（OPA）进行谷胱甘肽的荧光检测。
- 在指定的激发和发射波长下读取荧光值。
主要结果
- 经不同纳米材料处理后，A-549 细胞表现出不同的 GSH/GSSG 比值。
- 经 125 µg/mL 银处理后，GSSG 水平最高。
- 该检测方法在蛋白质定量方面表现出有效的归一化效果。
- 结果表明，该方法具有多重检测其他生物标志物的潜力。
结论
- 本方案为谷胱甘肽的定量分析提供了一种简化的流程。
- 该方法可整合到更广泛的氧化应激与生物标志物研究中。
- 该方法操作简便，无需昂贵的仪器设备。
常见问题
行业重要性概述
在培养的哺乳动物细胞中对还原型和氧化型谷胱甘肽进行定量评估，对于早期药物发现中细胞氧化还原状态和氧化应激反应的评价至关重要。该基于邻苯二甲醛（OPA）的检测方法可实现谷胱甘肽（GSH）和氧化型谷胱甘肽（GSSG）的快速、多重定量，支持无需专用仪器的可靠生物标志物分析。本方案可与归一化和细胞毒性检测兼容，有助于在药物发现和临床前研究流程中实现数据整合的标准化。
生物制药研发中的战略应用
早期发现与靶点验证
- 可直接测量细胞抗氧化能力，有助于揭示作用机制并降低研发风险。
- 支持在与疾病相关的模型中对氧化应激通路进行功能验证。
- 有助于快速验证靶点参与及通路调控的假设。
筛选与检测方法开发
- 为高通量化合物筛选提供标准化的定量读数。
- 可在多种细胞系中实现氧化还原调控的可重复性评估。
- 整合蛋白质归一化与细胞毒性评估，实现多参数输出。
转化与临床前研究
- 将氧化应激生物标志物的定量与转化终点相整合。
- 实现从体外发现到临床前模型验证的连续性。
- 基于细胞氧化还原状态支持经风险调整的推进决策。
流程与工作流整合
这种基于OPA的谷胱甘肽定量方法适用于从早期发现到临床前研究的连续过程，能够将氧化还原生物标志物分析无缝整合到先导化合物筛选和机制研究中。
- 发现生物学：支持对氧化应激通路进行假设驱动的探究及靶点验证。
- 筛选：提供适用于化合物初筛和检测方法标准化的定量、可重复的输出结果。
- 分析：基于荧光检测提供可靠的测量手段，用于细胞氧化还原状态的比较分析。
- 转化研究：在氧化应激作为相关终点时，连接体外研究结果与临床前生物标志物策略。
- 企业级复用：提供可扩展且适应性强的平台，用于跨多个项目进行氧化还原生物标志物的定量分析。
运营与企业影响
- 科学价值：提高对氧化应激通路调控及靶点验证的预测可信度。
- 操作价值：降低检测复杂性、缩短实验时间、减少有害试剂使用，同时实现多重检测输出。
- 战略价值：通过整合氧化还原生物标志物与细胞毒性及蛋白质归一化数据，提升“推进/终止”决策的准确性。
- 项目组合影响：基于机制性研究和生物标志物驱动的洞察，支持对资产进行风险调整后的优先级排序。
实施注意事项
- 需要具备基于荧光的实验建立与数据分析的专业知识。
- 需要配备荧光酶标仪及标准的细胞培养基础设施。
- 要求跨团队在标准化、归一化及细胞毒性评估整合方面保持一致。
- 可根据需要优化实验方案，适用于多种哺乳动物细胞系。
- 多重检测其他生物标志物的潜力取决于试剂的兼容性及验证结果。
