在体外溶栓模型中通过剪切流追踪钱德勒环路法形成的全血凝块的纤维蛋白溶解过程

血栓形成与多种疾病状态相关，而现有治疗方法存在严重出血风险。循环系统中的血流对血凝块结构具有显著影响。将血流因素纳入体外模型可能提高其生理相关性，从而改善体内试验候选药物的筛选效果。

研究纤溶作用的实验主要采用静态凝块或微流控系统，以评估溶栓时间、凝块结构或黏弹性等特性。静态凝块溶栓实验通常依赖分光光度法测量或凝块质量测定作为终点指标，以评价纤溶效率。目前的溶栓检测使用的是静态条件下形成的凝块，其结构与流动条件下形成的凝块存在差异。

微流控系统需要考虑流动动力学，但由于其尺度更小，会产生独特的血流动力学特征和血栓结构。目前开发的RT-FluFF实验方法可在生理流动条件下实时监测溶栓过程，操作简便。这意味着我们现在拥有一个可调控多个参数的平台，能够更贴近研究模型的生理条件，从而在筛选新型溶栓药物时实现更优的转化应用。

首先，将荧光标记的纤维蛋白原加入 3 毫升枸橼酸钠抗凝人全血中，使其终浓度达到每毫升 60 微克。在 37 摄氏度水浴中设置 Chandler 循环装置，使用直径为 120 毫米的滚筒。剪切一支标准的 200 微升 PCR 管，并连接管路两端。

为启动血液凝固，向3毫升全血中加入176微升200毫摩尔氯化钙。轻轻倒置混匀后，使用3毫升注射器将血液注入导管中，并立即将导管两端连接至钱德勒环装置的滚筒上。在低光照条件下，将滚筒部分浸入水浴中，以40 rpm转速旋转。

40至60分钟后，从导管中移除血凝块。大体Chandler环路中，FITC标记纤维蛋白原的全血样本在紫外光下显示荧光分布均匀。此外，在全血中改变FITC纤维蛋白原的浓度不会影响血凝块的重量。

首先，连接流动回路装置，并确保所有连接处均牢固。打开压力监测仪，确保进样口和出样口传感器的压力读数均为零毫米汞柱。

打开水浴并调节温度至37摄氏度，以模拟人体生理温度。启动泵并调节至所需流速，检查是否存在任何泄漏，并确认压力传感器功能正常。关闭泵以利于血浆流动相和血凝块的加载。

为测量先前制备的人全血凝块质量，将凝块轻轻在实验室擦拭纸上吸干，直至无明显液体渗出。将凝块浸入称重盘中血型匹配的拉血浆内。移除连接入口与出口传感器之间流环管路的中央部分，并将10毫升注射器连接至管路一端。

通过管路的自由端，用少量血浆预充管路。确定血栓的头端和尾端后，将头端朝向入口压力传感器。将管路置于血栓的尾端，并用注射器将血栓抽吸入管路中。

将管路连接到流动回路装置上，使血栓最靠近出口压力传感器，并将血栓头部朝外放置。为固定血栓位置，使用两根30号针头以交叉（X形）方式刺穿管路和血栓头部。将剩余的流动相溶液转移至一个50毫升离心管中作为储液罐。

将储液罐放入水浴中，然后将进液管和出液管插入储液罐。打开荧光计，通过与仅流动相系统的基线进行比较，确认初始值是否合适。

将500微升组织纤溶酶原激活物直接加入储液器中。启动泵并调节流速至160毫升每分钟。系统随后充满液体并产生气泡。

气泡消失后，关闭光源并开始数据采集。持续记录直至血凝块显著降解。在血浆流动过程中，监测血凝块前后的系统压力，随着血凝块质量减少，这些压力将在血凝块消化过程中发生变化。

凝块消化后，在泵仍在运行时降低流速，并移除进样管路，以将大部分液体推入储液器中。在出口压力传感器侧断开含有凝块的管路段，将其放入称量皿中。移除针头以收集剩余的液体和凝块碎片。

称量剩余血凝块。样品之间，将温水加入储液罐，并以150 rpm运行系统2分钟。当日所有样品检测完毕后，取下并丢弃管路。

用热水和毛刷彻底刷洗T型接头，直至清洁，然后将其晾干。用热水冲洗注射器减震器，并用70%乙醇擦拭，以保持无菌状态。