新生小鼠骨髓分离及骨髓来源巨噬细胞的制备

本研究的目的是了解新生儿对细菌感染的早期免疫反应中存在的一些局限性。为实现这一目标，我们需要建立并使用针对新生儿的特异性研究模型。从出生第7天的幼鼠中分离骨髓具有挑战性，且目前尚未建立完善的方法。

与其他骨髓来源的巨噬细胞相比，新生小鼠骨髓来源的巨噬细胞更为敏感且易于受到应激。本方案所采用的技术简单且可重复，可指导使用者在不使用任何酶的情况下，从小龄7至9天的新生小鼠中分离骨髓。

本研究提供了一种标准化的方法，用于从新生小鼠中分离骨髓来源的巨噬细胞，可用于解答有关新生期免疫学的问题。该可重复的方法为在多个专业领域推进新生期免疫研究提供了特定年龄的模型。在断头后，使用70%乙醇对麻醉后的新生小鼠尸体进行消毒。

使用镊子和尖头手术剪，在腹部与后肢之间做一切口。然后将后肢的皮肤向足部方向撕下。用锋利的镊子刮除附着在骨骼上的结缔组织和肌肉。

用剪刀剪下胫骨和股骨。使用镊子将胫骨和股骨放入盛有 MEM 培养基并置于冰上的离心管中。将骨骼转移至带有收集管的 40 微米细胞筛中。

用3毫升注射器活塞在滤筛上压碎骨骼，以释放骨髓。将细胞悬液在4°C下以350×g离心5分钟。吸除上清液，并将细胞轻轻重悬于0.2%氯化钠溶液中，制成低渗溶液以裂解红细胞。

立即加入等体积的1.6%氯化钠溶液，使溶液呈等渗状态。离心上清液并弃去裂解液。用完全DMEM重悬细胞，并使用自动细胞计数仪对细胞进行计数。

首先，将2000万个新生小鼠骨髓细胞接种至每个T75培养瓶中，每瓶加入10毫升含2.5毫升10% L929细胞上清液的完全DMEM培养基。将培养瓶置于37°C、5% CO₂条件下培养5天。在分化第3天，向培养瓶中加入2毫升L929条件培养基。

在20倍放大倍数的倒置显微镜下每日观察细胞。在第5天收集巨噬细胞时，吸去培养瓶中的分化培养基。用5毫升磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤细胞，以去除非贴壁细胞和血清蛋白。

向培养瓶中加入5 mL 0.05%胰蛋白酶-EDTA，置于含5%二氧化碳的37°C培养箱中孵育。5分钟后，加入5 mL DMEM，用移液器吹打使细胞脱落。将细胞悬液以350×g离心5分钟。

用一毫升完全DMEM培养基解离细胞腭。使用自动细胞计数器对细胞进行计数。在L929细胞上清液存在条件下，骨髓细胞在五天内分化为巨噬细胞。

从第二天开始观察到纺锤形细胞的形成，到第3天时近一半细胞呈现此形态，到第5天时大多数细胞均呈现纺锤形。首先，将小鼠新生骨髓来源的巨噬细胞重悬于不含酚红和抗生素的完全DMEM培养基中。以每象限200,000个细胞的密度，将500微升细胞悬液接种至35毫米四象限培养皿中。

从 -80 摄氏度取出预配置的大肠杆菌菌种。取适量体积的菌悬液加入 1.7 毫升微量离心管中，制备感染复数为 25 的细菌接种物。然后加入 PBS 至总体积为 1 毫升。

将细菌悬液在2000g下离心5分钟，并将沉淀重悬于50 µL PBS中。加入绿色荧光pH敏感性染料，使其终浓度为500 µmol/L，在避光条件下孵育20分钟以完成染料偶联。用1 mL PBS将细菌洗涤4次，每次在1000g下离心5分钟。

将沉淀重悬于500微升不含酚红的完全DMEM培养基中，并加入骨髓来源的巨噬细胞培养物。在37°C和5%二氧化碳条件下培养4小时。加入200纳克细胞通透性红色荧光染料以标记溶酶体。

细菌感染后，可在骨髓来源的巨噬细胞内检测到大量绿色荧光细菌的吞噬现象。绿色荧光进一步与指示酸化溶酶体的红色荧光共定位。在长达四小时的感染过程中，亦可观察到表达绿色pH敏感性染料阳性的新生小鼠骨髓来源巨噬细胞的吞噬作用及其形态变化。