从小鼠成年脑室下区分离、扩增及核转染神经干细胞

我们的研究重点是探讨成年哺乳动物大脑中神经干细胞群体的调控机制。了解调控神经发生微环境中神经干细胞的内在和外在分子机制，对于理解其生物学特性以及开发未来潜在的治疗应用具有重要意义。为了研究神经感觉行为，体内和体外方法均被广泛应用，其中体外神经干细胞培养因其可控的环境以及便于对该细胞群体进行操作和监测而尤为常用。

体外基因表达调控技术是研究分子机制并学习细胞生物学的多功能方法。然而，在神经干细胞中高效且可重复地过表达和敲低候选基因的方法在该领域仍具挑战性。传统的基因递送转染方法在中枢神经系统细胞中已被证明有效。

此外，这些方法会影响细胞的存活率和功能。因此，优化替代策略对于在神经干细胞中调控基因表达至关重要。本方案介绍了一种改进的核转染系统，可实现从成年小鼠侧脑室下区分离的神经干细胞培养物中高效进行基因递送，同时细胞存活率高于80%。要开始从已妥善实施安乐死的小鼠中提取脑组织，在将头部与身体分离后，首先沿矢状缝切开颅骨以暴露脑组织。

借助精细镊子，去除骨骼。此步骤中需小心操作，避免损伤颅骨下方的脑组织。使用刮铲，小心地将脑组织从颅骨中取出。

将其放入含有冷的杜尔贝科磷酸盐缓冲液（Dulbecco's phosphate-buffered saline，DPBS）的12孔板中。接着，将整个脑组织转移至硅胶垫上，进行解剖操作。使用解剖刀切除位于脑前部的嗅球以及位于后部的小脑，保留包含两侧侧脑室的脑中央部分。

然后沿大脑纵裂将脑组织分为两个半球，再分别对两个半球进行解剖。取其中一个半球，重新调整其方向，使内侧区域朝上。沿胼胝体切开脑组织，将大脑皮层和纹状体与海马、隔区及间脑分离，从而暴露侧脑室。

沿脑室的腹侧边界切除海马、隔区和间脑。然后切除侧脑室下区（SVZ）头端和尾端以外的组织，以及沿胼胝体走行的皮层组织。将组织倾斜，使侧脑室下区朝向侧面。

去除侧脑室下区（SVZ）下方的纹状体组织，以获得含有神经干细胞的薄层组织。将小鼠的两个分离出的SVZ组织置于含冷DPBS的12孔板中，直至进行后续组织处理。为从小鼠分离出的侧脑室下区（SVZ）中分离神经干细胞（NSCs），将每个SVZ切成四至五个小块，以促进组织的解离。

使用无菌的塑料巴斯德吸管，将切碎的脑室下区组织转移至15毫升离心管中，确保培养皿中无组织碎片残留。待组织沉降至管底后，吸除残留的DPBS。每两个脑室下区组织加入500微升含过滤木瓜蛋白酶的酶解混合液，将离心管置于37摄氏度水浴中孵育30分钟。

孵育后，向每个样品中加入5 mL预先在37摄氏度温育的对照培养基。在300×g下离心样品5分钟。使用微量移液器或真空泵小心吸去上清液。

使用火焰抛光的巴斯德玻璃移液管，向沉淀中加入一毫升对照培养基。通过上下吹打10至20次，小心地机械性分散沉淀，直至获得均一的细胞悬液。然后加入四毫升对照培养基，通过倒置混匀以洗涤细胞。

以300g离心5分钟后，用移液器上下吹打10次，将所得沉淀均匀重悬于1毫升完全培养基中。取细胞悬液一份与台盼蓝一份混合稀释后，使用血细胞计数板在显微镜下计数细胞。在将细胞以每孔500微升完全培养基的终体积平均接种至48孔板的八个孔之前，需确保细胞已充分解离至单细胞水平。

将细胞孵育5至7天，以促进原代神经球的形成。为了传代来自小鼠脑室下区分离的神经干细胞所获得的神经球，收集含有神经球的培养基，并将其转移至15毫升离心管中。在300×g条件下离心神经球5分钟。

去除上清液后，向沉淀中加入200微升酶解液，轻轻敲击离心管底部以充分悬浮沉淀。室温孵育10分钟，以促进神经球的解离。随后加入1毫升对照培养基以终止酶反应。

使用P-1000移液器将神经球机械吹打10至20次以进行解离。加入额外的4毫升对照培养基，通过轻柔颠倒混匀以洗涤细胞。在300g离心5分钟，随后弃去上清液。

加入1毫升完全培养基，通过上下吹打10次重悬细胞沉淀，以混匀细胞悬液。取一份细胞悬液与一份台盼蓝溶液等体积混合稀释后，使用血细胞计数板（Neubauer计数室）进行细胞计数。为扩增培养，将细胞以每平方厘米10,000个细胞的密度接种于适当规格的培养板或培养瓶中，并加入完全培养基。

使用推荐的试剂盒，为每种所需的核转染条件在1.5毫升离心管中制备95微升核转染溶液。同时，为每种条件准备一个含有4毫升预热完全培养基的T25培养瓶，并将其置于培养箱中直至使用。进行核转染时，将所需数量的细胞在300g离心5分钟，然后去除上清液。

加入1毫升DPBS，通过上下吹打10次将沉淀均匀重悬。重复离心后，将沉淀重悬于95微升的核转染溶液中。将95微升细胞与预先混合的质粒溶液混合，该溶液包含所选用于核转染的每种质粒各5微升。

将该溶液转移至比色杯后，将其放入Nucleofector装置中，并使用Nucleofector系统的优化神经干细胞程序进行细胞核转染。电穿孔完成后，使用试剂盒中提供的巴斯德吸管，小心地将预热的完全培养基加入比色杯中。随后将比色杯中的内容物转移至先前准备好的、含有预热完全培养基的T25培养瓶中。

将核转染后的细胞置于37摄氏度、5%二氧化碳的湿润培养箱中孵育三至五天，并观察核转染后的神经球。