从小型组织和细胞培养样品中分离线粒体用于线粒体超复合物分析

我们的研究重点是深入理解线粒体生物发生过程，特别是氧化磷酸化（OXPHOS）系统的组织结构与调控机制，同时也致力于阐明线粒体在从癌症到神经退行性疾病等多种疾病中的作用。线粒体在细胞中执行多种关键功能，影响细胞的整体代谢与存活。

我们正逐步加深对线粒体复杂性及其在健康与疾病状态下细胞适应机制中所起作用的理解。我们提出并建立了一种新的氧化磷酸化（OXPHOS）系统组织模型——可塑性模型。该模型整合了以往的假说，认为超复合物与游离复合物以不同比例共存，从而优化其功能，并支持细胞的适应性调节。

本实验方案允许从少量组织或细胞培养样品出发，获得足量的线粒体蛋白，用于通过蓝色天然电泳或其他技术分析超复合物的组装、状态和功能。我们可在短时间内使用简单设备以相对较低的成本重复实现这一过程。实验开始时，将压紧的细胞沉淀重悬于低渗缓冲液中，缓冲液体积为细胞沉淀体积的七倍。

将细胞悬液转移至Potter Dounce匀浆器中，冰上孵育2分钟，使细胞充分肿胀。使用连接于600 RPM电机驱动的聚四氟乙烯（Teflon）研杵进行8到10次匀浆，以破坏细胞膜。向细胞悬液中加入等体积的高渗缓冲液，以形成等渗环境。

将匀浆转移至10到15毫升离心管中。在4°C条件下，以1,000 G离心5分钟，收集上清液至1.5毫升聚丙烯离心管中。为收集线粒体粗提组分，在4°C条件下，使用微量离心机以16,000 G离心2分钟。

弃去上清液，用 0.5 毫升缓冲液 A 重悬富含线粒体的沉淀。将两支试管中的内容物合并至一支试管中，并按之前所述进行离心。最后一次离心后，将沉淀重悬于 300 微升缓冲液 A 中。使用 Bradford 法测定线粒体蛋白浓度。使用剪刀剪取 20 至 30 毫克动物组织。

使用滤网在匀浆缓冲液中清洗组织三到四次，注意避免丢失较小的组织碎片。将带有缓冲液的组织碎片转移至匀浆器中。对于肝脏、脾脏和肾脏组织，使用电机驱动的聚四氟乙烯研杵在LVEM Potter匀浆器中以600 RPM的速度进行四到六次上下研磨。

首先，用天然蓝色上样缓冲液重悬从哺乳动物细胞培养物或组织中获得的线粒体组分，使蛋白浓度约为10毫克/毫升。为溶解线粒体膜，加入皂苷素（digitonin），使其终浓度为每克线粒体蛋白加入4克皂苷素。轻轻吹打混匀，并于冰上孵育5分钟。

将悬浮液在微型离心机中于 4°C 条件下以 20,000 G 离心 25 分钟，以去除不溶性物质。将上清液收集至新离心管中，然后加入相当于初始重悬体积三分之一的 5% 考马斯亮蓝 G-250，用移液器吹打混匀。将冷的阴极 A 缓冲液加入电泳装置的上层室，阳极缓冲液加入下层室。

将30至100微克线粒体蛋白加入聚丙烯酰胺凝胶的加样孔中。电泳结束后，将凝胶放入塑料盒内。加入足量的适当凝胶内活性检测溶液，以完全覆盖凝胶，并在室温下避光、轻柔振荡孵育。

当出现适当的条带后，移除检测溶液。用蒸馏水洗涤凝胶两次，然后用40%甲醇和10%乙酸固定30分钟。凝胶活性检测分析显示，小鼠和人类细胞中存在明显不同的超复合物组装模式。

在小鼠细胞中观察到游离的复合物一，而在人类线粒体中则无法检测到。人类细胞系中的复合物四模式相似，但由于 SCAF1 的突变 variant，小鼠细胞系中的复合物四模式存在差异。