抗分枝杆菌高通量药物筛选的检测方法开发

脓肿分枝杆菌对抗生素具有高度耐药性，其耐药水平仅可与多药耐药结核病相提并论，且目前尚无获批的治疗方法。我们的研究致力于利用双报告基因菌株和i3S技术，开发一种可扩展的药物筛选方案。该方法旨在提高检测效率，加速发现更有效且毒性更低的药物，并简化脓肿分枝杆菌的潜在治疗方案。

针对脓肿分枝杆菌感染的药物开发依赖于传统的耗时方法，如菌落形成单位计数，这些方法劳动强度大、通量低，且容易受到人为偏差的影响。由于该细菌具有高度耐药性，导致潜在有效化合物的发现较少。因此，为了寻找新的治疗方法，对数千种化合物进行高通量筛选至关重要。

然而，传统方法使得这一目标难以实现。我们的实验方案采用了一种自主研发的双报告基因分枝杆菌菌株，可同时发出生物发光和荧光信号。该方法使研究人员能够在无需添加任何额外试剂或步骤的情况下评估化合物的治疗效果，从而提高了实验速度和可重复性。

此外，i3S 生物科学筛选平台采用机器人自动化技术进行高通量筛选实验，可无人工干预地处理 105 块微孔板，从而提高效率并减少误差。该方案能够加快对脓肿分枝杆菌的药物筛选速度，并提高可重复性，有助于发现新的候选药物。该方法可揭示关键的细菌靶点或化合物功能基团，为成功与失败的候选化合物均提供重要见解。

该方法可简化药物研发流程，指导未来的研究方向，并加快针对脓肿分枝杆菌的潜在先导化合物的筛选。为从野生型成年小鼠的骨髓中获得巨噬细胞，将骨髓细胞接种于含DMEM的96孔光学处理平底板中，DMEM中添加10% FBS和10% LCCM。将细胞在37°C、7% CO₂条件下孵育10天。

分化后，将75微升脓肿分枝杆菌悬液用移液器加入含有巨噬细胞的孔中。将细胞在37°C、含7%二氧化碳的条件下孵育4小时。使用配备小型盒带的微孔板试剂分配器，向化合物或溶剂对照孔中加入110微升DMEM，该培养基需添加10%胎牛血清（FBS）和10%条件培养基（LCCM）。

向含有化合物或溶剂最高浓度的列中，加入额外的104微升DMEM，该DMEM需添加10% FBS和10% LCCM。现在，将5.9微升的化合物或溶剂加入其指定列中的孔内。使用多通道微量移液器，对每种化合物和溶剂进行两轮连续稀释。

最后一次稀释后，弃去最后一孔中多余的110微升培养基。除空白孔外，向所有列中加入110微升DMEM，该DMEM中添加有10% FBS和10% LCCM。用DMEM配制浓度为2微克/毫升的克拉霉素溶液。

孵育结束后，从孵育箱中取出含有感染巨噬细胞的96孔板。使用酶标板洗板机，用200 µL感染洗涤液将细胞洗涤三次。向含有感染巨噬细胞的孔板中加入200 µL的化合物。

然后向各自的孔中加入 200 µL 添加了补充物的细胞培养基和克拉霉素溶液。将培养板置于 37 °C、7% CO₂ 条件下孵育 48 小时。孵育结束后，用 200 µL 化合物洗涤液分别洗涤感染的细胞三次。

使用多通道微量移液器，向所有孔中加入 200 微升固定液，孵育 10 分钟。洗涤细胞后，向所有孔中转移 200 微升通透液，孵育 15 分钟。接着，吸去通透液，然后向所有孔中加入 100 微升染色液。

在室温下孵育30分钟。孵育结束后，用200 µL化合物洗涤液洗涤细胞3次。使用高内涵成像系统检测时，选择板类型为96微孔板，物镜为20 ×，数值孔径为0.4，模式为共聚焦。

随后，选择 DAPI、细胞膜、深红色和 M cherry 通道，分别用于捕获染色的细胞核、细胞质和细菌信号。选择培养板中的孔以及每个孔的相应视野进行分析。接下来，点击测试并拍摄一张图像以检查设置。

最后，设置一台设备操作机器人，以实现夜间自动进行图像采集。该机械臂可在无需人工干预的情况下，在高内涵成像系统中自动更换培养板。柔红霉素、多柔比星、生物甾醇、表柔比星和吡维铵甲苯磺酸盐对感染分枝杆菌的巨噬细胞具有毒性，导致细胞存活率低于85%。在13.3 µM浓度下，莫拉克坦和贝西沙星对分枝杆菌的存活率低于50%，但与DMSO对照组相比无显著差异。

化合物头孢地尼、加替沙星和莫西沙星在13.3 µM浓度下对胞内分枝杆菌具有强效活性，其中吡维铵苯甲酸盐活性最强。罗红霉素、克拉霉素和利福布汀对胞内分枝杆菌表现出极强的活性，其中克拉霉素在所有浓度下均使其存活率降低至10%以下。