从废水中增强提取低分子量DNA以全面评估抗菌素耐药性

我们关注抗生素耐药性的进化、传播及其分子机制。具体而言，本论文的研究工作源于我们对环境耐药性的兴趣。目前，我们正尝试利用一年的数据建立一个本地数据库，以追踪抗菌耐药性的时空变化。

采用基于培养的技术与基因组学相结合的方法来检测和监测抗菌素耐药性。对样品中的DNA进行PCR或鸟枪法测序，以分析微生物多样性并检测耐药基因。此外，还使用宏条形码和基于基因的AMR检测面板进行更高级的抗菌素耐药性检测。

已知断裂的低分子量 DNA 是耐药基因（AMR 基因）的储存库，但目前针对高效提取线性且低分子量 DNA 的方法研究较少。本研究旨在弥补这一空白。我们的实验方案引入了一个简单的预处理步骤，以提高从废水中提取的低分子量 DNA 的富集比例。

因此，该方法能够完整捕获环境中的抗菌素耐药性（AMR），而不会排除游离DNA组分。经过进一步优化，该方案可发展为无需试剂盒的方法。这继而为开发经济高效的环境AMR捕获技术铺平了道路。

我们希望超越耐药性的表型抵抗，探究非遗传机制在抗生素耐药性中的作用。我们特别关注比较水平基因转移和基因组突变在不同环境中对细菌适应抗生素的相对贡献。首先，将27.5毫升废水转移至50毫升离心管中。

向试管中加入13.5克聚乙二醇8,000和3克氯化钠，充分混匀直至完全溶解。将样品在4°C下孵育过夜。第二天，在4°C条件下以15,500 G离心30分钟。

弃去上清液，将沉淀物溶于800微升土壤DNA提取试剂盒中的裂解液中。然后将溶液加入混合的氧化锆珠管中。将珠管水平固定在涡旋振荡器上，以最大速度涡旋振荡20至30分钟。

在8,000 G下离心管子15秒。去除泡沫后，将上清液转移至1.5毫升微量离心管中。在15,000 G下离心上清液1分钟。

将上清液转移至一个洁净的2毫升微量离心管中，加入200微升沉淀溶液。最大速度涡旋震荡5秒，随后在4摄氏度下孵育5分钟。再次离心混合物，将澄清的上清液转移至另一个洁净的2毫升微量离心管中。

每 700 微升上清液中加入 600 微升结合缓冲液。涡旋混匀后，将 700 微升裂解液上样至硅胶离心柱中，孵育 2 分钟。以 15,000 G 离心 1 分钟，弃去穿流液。

现在，小心地将离心柱放入一个干净的 2 毫升收集管中。向离心柱中加入 500 微升洗涤缓冲液，在 15,000 ×g 条件下离心 1 分钟。弃去穿流液，并将离心柱重新放回同一个 2 毫升收集管中。

向离心柱中加入 500 微升乙醇洗涤缓冲液，在 15,000 G 条件下离心一分钟。弃去流出液，将离心柱放入新的 2 毫升收集管中。在 16,000 G 条件下离心两分钟，以去除残留的乙醇。

将离心柱放入一个1.5毫升离心管中。向白色滤膜中央加入100微升预热的无核酸酶水，孵育5分钟。然后在15,000 G离心1分钟。

向洗脱的DNA中加入10微升3摩尔的氯化钠溶液和250微升预冷的无水乙醇，颠倒混匀。在8,000 G下离心15秒。将DNA与乙醇的混合物于-20摄氏度孵育1小时。

然后，在 4°C 条件下以 19,000 G 离心混合物 30 分钟，倾倒试管以弃去上清液。向沉淀中加入 500 µL 冰冷的 70% 乙醇，在 4°C 条件下以 19,000 G 离心 15 分钟。弃去上清液，并将试管轻轻在纸巾上轻敲以去除残留的乙醇。

然后，将离心管敞口置于37摄氏度的加热块上5至10分钟，以干燥DNA沉淀。用30至50微升无核酸酶的水重悬沉淀，并在37摄氏度孵育5至10分钟。在8,000 G离心15秒，使DNA沉淀。

在纳米滴分光光度计上，选择核酸设置下的双链DNA应用。使用无绒布和水清洁样品台。用无核酸酶的水对仪器进行空白校准。

然后，擦拭样品台，并在上面加载 2 µL 的 DNA 样本。测定浓度和吸光度比值以确定纯度。测量后，将样本储存在 -20 °C 条件下。