利用三电极双室生物电化学系统表征乳酸菌的介导型胞外电子传递

在我们的实验室中，我们研究植物乳杆菌（lactiplantibacillus plantarum）等细菌的胞外电子传递（EET）。植物乳杆菌是一种在食品工业中具有重要作用的发酵细菌。在EET过程中，细胞将电子传递给胞外的电子受体，例如生物电化学系统中的电极。我们希望深入理解并改造EET，以应用于生物传感、生物催化和食品发酵等领域。

我们发现，在存在醌类物质（如DHNA）的情况下，高山隧道菌可通过胞外电子传递（EET）获取电流。该过程可再生NAD+，加速主要发酵途径的总体损耗，并促进细胞生长。此外，我们发现除DHNA外，多种醌类衍生物也能介导植物乳杆菌（L. plantarum）的胞外电子传递（EET）。

研究介导的电子传递（EET）需要专门的生化实验装置。具体而言，我们采用三电极双室生物电化学系统，以防止阳极反应与阴极反应之间的相互干扰。此外，我们使用具有较大表面积的碳纤维工作电极，以增强电子介体的电子传递效率。

我们对植物乳杆菌（L. plantarum）中电子传递链（EET）途径及其与发酵代谢相互作用的研究，可能在食品工业中具有实用价值。已知EET和植物乳杆菌能够改变发酵过程中的代谢通量，这一特性可被加以调控，用于改善食品风味或在电发酵过程中生产有价值的化学品。未来，我们将继续深入探索EET的基础生物学机制，并致力于在植物乳杆菌等微生物中开发新型EET应用。

我们计划对电子传递途径（EET）中的蛋白质进行改造，这将使我们能够进一步控制电子传递，从而应用于电发酵和生物传感。首先，使用氧化铝砂纸将预先切割好的直径为1毫米的钛丝打磨，用于工作电极和对电极，直至表面均匀发亮。然后用镊子将每个工作电极的一端弯成一个小钩状。

将一块16平方厘米的碳纤维毡圆片滑入每个工作电极导线上，将导线在碳纤维毡圆片中穿入穿出一次，并将圆片沿导线向下拉至固定在钩子上。通过将导线刺穿橡胶隔垫并拉出几厘米，将工作电极固定到GL 45瓶盖中。为构建成对反应器，先组装O形圈，然后将预先切割并已在水中预浸泡过的阳离子交换膜放入已组装的O形圈内。

将带有膜的O形圈置于成对反应瓶的两个大底部开口之间。使用肘节夹固定成对的反应瓶及带膜的环。在用配有橡胶隔垫的GL14盖子封闭每个瓶顶部所有小开口之前，向每个阳极室中放入一根磁力搅拌子。

向每个反应瓶中加入 110 毫升去离子水。将带有碳毡圆形工作电极的瓶盖插入，并轻轻按压毡垫顶部，使其固定在挂钩上。使用配备电极的适当 GL45 瓶盖密封瓶口。

将装有水的反应器和GL14电极帽进行高压灭菌。在无菌条件下，从甘油保藏管表面刮取植物乳杆菌（Lactiplantibacillus plantarum）菌体，接种于3 mL商业脱脂玫瑰氏培养基（de Man, Rogosa and Sharpe medium，MRS培养基）中。于37摄氏度静置培养过夜。

首先，在无菌生物安全柜中，弃去生物电化学系统反应器中的灭菌水。向阴极室加入 110 毫升灭菌 M9 培养基，向阳极室加入 110 毫升 freshly prepared MCDM。将阳极室的一个 GL14 帽更换为带有硅胶密封垫圈的灭菌 GL14 帽。

将制备好的参比电极用70%乙醇喷洒，然后通过电极帽插入每个阳极室中。拧紧所有瓶盖和夹具，以防泄漏。要将反应器连接到水泵系统，请先将每个反应器放置在相应的搅拌子平台上。

然后用橡胶管将每个反应器的水夹套接头依次连接，将末端的反应器连接至水泵的进水和出水管。向水泵中注满水，并加入四到六滴水质调节剂。启动泵系统，将温度设定为30摄氏度。

启动泵并观察水流通过所有反应器的水夹套，确认无泄漏。打开搅拌平台，将其设置为220 RPM的连续搅拌。将反应器连接至氮气保护气管路时，首先将空气过滤器连接到22号针头上，然后将针头穿过反应器阳极室顶部的隔垫插入培养基中。

将一根18号针头插入反应器阳极室顶部的隔膜，然后将氮气源的气体管路连接到空气过滤器，并打开阀门，使气体缓慢地通过反应器。将生物反应器连接至恒电位仪导线时，需将恒电位仪的工作电极、对电极和参比电极的鳄鱼夹导线分别连接到对应的电极上。输入所有参数后，按下绿色启动三角形按钮以开始运行。

观察开路电压曲线数分钟，确保所有反应器读数均为正值，且信号稳定、数值接近。在无菌条件下，将先前培养的植物乳杆菌（L. plantarum）培养物按1:200的比例转接至50毫升MMRS培养基中。

将细胞在37摄氏度下静置培养过夜。首先，从培养箱中取出在MMRS中培养的L plantarum菌种。在无菌条件下，将菌液转移至50毫升锥形管中，并将管子置于冰上。

在 4,000 G 条件下，于 4 摄氏度离心培养物 5 分钟。弃去上清液，将沉淀重悬于 50 毫升 PBS 中。第二次洗涤后，将细胞重悬于冷 PBS 中，调节 600 纳米处的光密度至 11。

将两毫升重悬的细胞加入一个三毫升、配有针头的注射器中。在反应器工作站处，取下细胞注射器的封帽，将针头插入反应器阳极室的顶部。待所有注射器就位后，下压推杆以注入细胞。

从计时安培法曲线中记录注射时间。让电流在曲线上稳定两到四小时。在生物电化学系统中，将实验反应器标记为加DHNA，将溶剂对照反应器标记为减DHNA。

取一支装有110微升浓度为20毫克/毫升DHNA的注射器，去掉针帽，插入指定为加DHNA的阳极室顶部。另取一支装有110微升DMSO的注射器，插入指定为不加DHNA的阳极室。使用一支配有21号针头的3毫升注射器，通过未使用的带隔垫小帽，从每个阳极室中抽出2毫升培养基。

将样品转移至24孔深孔板，测定零小时时间点的pH值。按压DHNA和DMSO注射器的推杆，将试剂注入反应器中。从计时安培法曲线记录注射时间。

弃去所有注射器和针头。24小时后，按照之前所述方法，从每个阳极室中取出两毫升培养基，并转移至24孔深孔板中用于24小时pH值测定。对24小时时间点进行循环伏安法检测。

测定并记录每个反应器24小时样品的pH值。由于胞外电子传递产生的电流密度在DHNA注入后8小时达到峰值，约为132微安/平方厘米。相比之下，DMSO注入后产生的电流密度可忽略不计。

循环伏安法数据显示，在存在 L plantarum 和 DHNA 的情况下，50 毫伏时氧化电流显著增加，与含 DMSO 的 L plantarum 相比，在 300 毫伏时电流密度增加了 256%，与非生物性 DHNA 曲线相比亦是如此。在含有 L plantarum 和 DHNA 的样品中，胞外电子传递导致 pH 值在 24 小时内显著下降至平均 3.33，而含有 L plantarum 和 DMSO 的样品平均 pH 值为 6.50。