高分辨率细胞移植在胚胎期和幼体期斑马鱼中的应用

我们的实验室研究在发育和再生过程中，神经系统中的细胞连接性是如何被调控的。我们通过细胞移植来研究环境信号如何影响神经细胞的行为，探讨当这些细胞被置于不同的遗传、空间或时间环境中时，其行为发生的变化。虽然细胞移植在斑马鱼胚胎中较为常见，但通常是在囊胚期和原肠胚期进行，此时细胞大多尚未分化。

这对于生成遗传嵌合体具有重要价值，但该技术在研究时空信号动态如何影响这些阶段之后的发育过程方面存在局限性。本文介绍了一种可在胚胎和受精后至少七天内的幼体中进行细胞移植的方案，包括已分化的神经元。我们能够以高时空分辨率移植少至一个细胞，并利用遗传性荧光标记对宿主动物体内移植的细胞进行长期追踪。

该方案使我们能够在多个不同的发育阶段改变细胞的遗传、空间和时间环境，为研究发育和再生过程中信号传导的原理开辟了新的机会。首先，在载玻片上用透明指甲油绘制一个矩形轮廓。准备若干张此类移植载玻片。

固定麻醉后的动物时，使用巴斯德吸管和移液器将其从 RPT 转移至低熔点琼脂糖（LMA）中。然后将动物连同少量 LMA 液滴转移至载玻片上指甲油轮廓内的区域。在 LMA 凝固前，使用胚胎推针将动物垂直摆放，使预定的针头插入位置朝向右侧，并让琼脂糖完全凝固约五分钟。

使用解剖刀，在固定动物右侧的琼脂糖滴上垂直切出一条竖直切口。将载玻片上松散的琼脂糖擦拭干净。使用解剖刀从琼脂糖中切出楔形部分，以暴露针头插入部位。

将RPT加到载玻片上，直至琼脂糖液滴完全浸没，然后将制备好的载玻片置于移植显微镜上。降低40倍物镜，使其接触培养基表面，再缓慢抬升至视野中出现供体动物，随后调节焦距使荧光标记的目标供体细胞清晰可见。

将载物台向左移动，为定位移植针做准备。首先，将微量移液器插入微量移液器拉制仪中，拉制出显微注射针。在解剖显微镜下，将针尖与载物台测微尺的刻度对齐。

以千分尺作为测量参考，使用经过 sharpened 的一对镊子将针头折断至内径略大于细胞直径的大小。使用配备移液管填充器的 50 毫升注射器，将矿物油完全充满针头。在移植装置上，转动三通旋塞，使其长臂朝向微量注射泵。

按压储液器注射器的推杆，以排出液压管路中的所有气泡。保持对推杆的轻微压力，转动三通旋塞阀，使长臂端口朝向储液器注射器。然后将针头插入 holder，过程中避免引入气泡。

调整针头，使其与水平方向成10至15度角，正对左侧。使用粗调和微调显微操作器，在显微镜物镜下移动针尖，使其进入焦点。若液体正在流入或流出针尖，调节注射泵压力，直至在油相与RPT之间观察到稳定的弯月面。

如果仍有油泡存在，将针向右移动，使其针尖退出RPT，然后再向左移动以重新定位。将载物台向右移动，直至供体动物重新进入视野。重新居中并对焦待移植的细胞，将针与动物体外侧的细胞对齐。

接下来，将针插入供体动物体内，如有必要，使用微量注射泵重新稳定针尖处的油-液弯月面。将针尖置于目标细胞附近，利用微量注射泵施加轻柔的负压。在吸入足够量的细胞后，将针从供体中取出，并再次用微量注射泵稳定针尖内的样品。

调整载物台位置，使第一个宿主动物进入视野。将细胞预定放置区域居中并调焦，并将针头与动物体外的该区域对齐。随后将针头插入宿主动物体内，并重新稳定针尖处的油-液弯月面。

将针尖置于移植位点，使用微量注射泵施加轻柔压力，直至针头释放出预定数量的供体细胞。最后，将针头从宿主体内取出。移植后12小时，在宿主迷走神经运动核的前部成功观察到供体神经元，显示出健康的神经突起始迹象。

移植后两天，移植的神经元不仅保持在正确的位置，而且已开始向第四咽弓延伸新的轴突，表明其已在宿主体内成功整合。