量化 Drosophila melanogaster 眼部表型：整合 ilastik 与 Flynotyper 的计算方法

我们致力于为肌萎缩侧索硬化症（ALS）、额颞叶痴呆（FTD）以及多系统蛋白病等疾病建立疾病模型，以深入理解其分子病理机制。我们所采用的一种模型是果蝇复眼系统。由于果蝇复眼具有规则且对称的结构模式，可用于评估引入基因突变和基因表达变化所造成的影响。

本方案针对粗糙眼表型定量方法中存在的不足进行了改进，特别是由人工分级所造成的局限性。人工分级主要依据小眼融合、小眼缺失以及刚毛排列的有序性进行判断。

然而，这可能导致偏差。因此，结合 Ilastik 和 Flynotyper 可建立一种更稳健的异常眼表型排序方法。由于具有更高的稳健性，我们的方案相较于人工排序具有优势。

即使是未经专门培训的实验室成员也能成功完成定量分析，而手动分级则可能需要经过更多培训的研究人员，以避免不同研究者之间出现评分差异。因此，本方案可节省时间和资源。我们的研究进展在于，该方案能够更准确地量化粗糙眼表型，尤其是对眼部形态的微弱改变。

由于在主要排序时存在偏差，使用 Ilastik 和 Flynotyper 进行分析将获得更准确的评分，从而得到更精确的发表书籍结果。首先，将健康和退化的黑腹果蝇（drosophila）眼部图像放入同一文件夹中，并确保文件命名恰当，以识别实验组别并区分雄性和雌性。打开 Ilastik 软件。

单击“创建新项目”。然后从其他工作流程中选择细胞密度计数，并选择保存项目文件的位置。依次单击一个输入数据、添加新项，再添加单独的图像以选择标准图像。

然后点击“双特征选择”并选定特征。选择更多的sigma值以提高灵敏度，点击“三重计数”并将前景sigma值设置为5.00。使用前景工具，在标准图像上标记50个或更多的单个小眼（Ommatidium）。

再次点击“三重计数”，并使用背景工具标记小眼外部区域。在小眼周围以网格状绘制绿色线条。点击“四重密度导出”，选择导出图像设置以调整图像参数。

然后单击输出文件信息，选择 TIFF 格式以便在 Flynotyper 中进行进一步分析，单击五次批量处理。选择原始数据文件，并选中所有待分析的实验果蝇照片。待分析图像的导入列表显示在“选择原始数据文件”下方。

单击五项批量处理部分底部的“处理所有文件”按钮。软件完成处理后，检查包含实验果蝇眼图像的文件夹，确认其中存在以“您的样本名称_probabilities”命名的黑色图像。

在 ImageJ 中打开由 Ilastik 生成的 tiff 文件。使用矩形选择工具在眼睛周围绘制一个矩形。

选择 ctrl 加 X 或 ctrl 加 C 以裁剪区域，并等待一个与矩形轮廓形状相同的黑色框出现。随后依次点击文件、新建和内部剪贴板，以打开裁剪后的果蝇眼睛图像。要将裁剪后的果蝇眼睛保存为 JPEG 格式，请点击文件、另存为，然后选择 JPEG。在 Image J 中，点击插件和 Flynotyper。

在基因型选项中，选择“添加基因型”，然后打开包含切割后的果蝇眼睛图像的文件夹。勾选“光学显微镜”和“垂直”选项。接着，在“按……排序小眼”选项下，勾选“稳定性”和“与中心距离”选项。

将考虑的排序小眼数量设置为200。点击运行，等待分析结果出现。将样本文件和P值复制粘贴到统计软件中进行进一步分析。

使用 Ilastik 处理并在环形光源下分析的果蝇眼部图像，相较于未使用环形光源的图像，呈现出更清晰的小眼（Ommatidial）模式，从而提升了定性评估效果。Flynotyper 分析结果显示，中度和重度退变果蝇眼部的表型评分显著高于未退变眼部。当未使用 Ilastik 时，未退变与中度退变果蝇眼部之间的 P 评分相似。