马肠神经胶质细胞培养及其在马腹痛神经炎症机制研究中的应用

马匹在结肠手术后常面临严重的炎症性术后并发症。在人类医学研究中，肠胶质细胞因其对肠道环境的关键感知作用以及对炎症的调控影响而日益受到关注。本研究旨在从马的小肠中分离肠胶质细胞，以评估其在理解与预防术后并发症中的作用。我们已建立了一种可重复的实验方案，用于从马肠组织中分离黏膜下层的肠胶质细胞。

我们还成功展示了其在研究炎症性肠胶质细胞对肠道屏障功能影响方面的应用，这可能对未来腹痛、术后并发症及肠道疾病的研究具有重要意义。本实验室将继续聚焦肠胶质细胞在炎症性肠道环境中的作用关系，以及抗炎生物制剂如何通过防止屏障功能丧失来预防术后并发症。首先，用包被液对24孔板进行包被，并在37摄氏度下孵育2小时，或在室温下过夜孵育。

用无菌水将培养板洗涤两次，并在室温下保存，直至细胞准备好进行铺板。现在，取一段马的空肠，将其置于冰上的冷林格液中。从空肠上取下一段10厘米长的组织，在对系膜缘切开，使非淋巴区域位于中央。

然后将组织修剪成约七乘七厘米的片状，并在解剖前用新鲜的任氏液充分冲洗。现在，将组织黏膜面朝上置于盛有冷任氏液或PBS的硅胶弹性体涂层培养皿中，并用大头针固定，尽可能将其拉伸。使用弯头镊子去除肠绒毛，然后从约五乘五厘米的非淋巴区域去除黏膜下层。

接下来，使用显微解剖剪从一角开始，将黏膜下层完整剥离并取出。在剥离黏膜下层与内环行肌层时，观察其自然分离的现象。然后将收集的黏膜下层组织剪切成2至5毫米大小的片段。

将它们放入含有5毫升不含FBS、胶原酶、蛋白酶和BSA的Organo的50毫升锥形管中。在37摄氏度下孵育组织2至3小时，以进行酶消化。孵育后，加入10毫升室温下含FBS的Organo以终止酶反应。

使用10毫升血清移液管将组织混合物上下吹打15次，以使细胞从组织中解离。然后在室温下以3,000 G离心3分钟。随后弃去上清液，并用10毫升室温的PBS重悬沉淀，使用10毫升血清移液管将溶液上下吹打15次。

将锥形管在室温下以 3,000 G 离心三分钟。弃去上清液后，加入 10 毫升室温含 FBS 的 Organo 溶液，通过上下吹打 15 次重悬沉淀。接着，依次通过孔径为 100 微米、70 微米和 40 微米的细胞滤筛过滤细胞。

离心细胞并弃去上清液后，用1毫升含FBS的Organo重悬细胞沉淀。然后用台盼蓝染色以鉴别活细胞，并使用血细胞计数板进行细胞计数。随后，将约400,000个细胞接种于24孔板的每个孔中，每孔体积为300微升含FBS的Organo。

向每个孔中加入 5 µL N2、5 µL G5 和 10 µL B27。将培养板置于含 5% CO₂ 的 37 °C 培养箱中，以促进细胞贴壁。当第一代细胞达到 70% 至 80% 汇合度时，分别用 0、10 和 25 纳克的白细胞介素-1β 处理各孔 24 小时。

在培养物中观察到呈梭形的细胞，其形态与肠胶质细胞一致，具有多形性，且其他细胞类型的污染极少。首先，用42微升0.05% Matrigel包被Transwell小室。在37摄氏度下孵育1小时，使Matrigel凝固。

吸去多余培养基，将Transwell小室敞口干燥30分钟。随后向每个插入物中加入200微升DMEM/F12培养基，于37摄氏度保存备用。用PBS洗涤含有类器官的Matrigel凝胶块。

将细胞置于冰上，加入 500 µL 细胞回收液，反复吹打混匀，确保将细胞完全收集至 15 mL 离心管中。随后在 4 °C 条件下以 300 ×g 离心 5 分钟。弃去上清液，并将细胞沉淀重悬于目标体积的肠道上皮干细胞（IESC）培养基中。

现在，用 IESC 培养基预润一毫升注射器。用16号针头吸取细胞悬液。然后将16号针头更换为28号针头，并推出悬液，以促进类器官的分离。

接下来，将200 µL上述细胞悬液加入经包被的Transwell小室的顶端。在基底侧加入500 µL IESC培养基和生长因子。使用双电极TEER测量装置定量单层细胞的TEER值。

向培养杯中加入 1.5 毫升 IESC 培养基，并确保 Transwell 小室中恰好含有 200 微升培养基，以便在测量期间保持液面水平一致。将 Transwell 小室的基底侧暴露于白细胞介素-1β 的炎性细胞因子或经白细胞介素-1β 处理的培养物所释放的胶质细胞产物中。通过将每个 Transwell 放入培养杯中，每隔 10 至 15 分钟测量一次 TEER，持续 45 分钟。

基底外侧暴露于经10和25纳克白细胞介素-1β处理的胶质细胞培养上清液，可显著增加上皮屏障通透性。在不同浓度马白细胞介素-6处理后，未观察到上皮通透性显著增加。