小鼠视网膜血管周细胞的免疫染色三维可视化

本研究的目的是利用先进的成像技术，研究寄生虫在视网膜血管系统中的形态学特征及其空间分布。为了提供详细的视图以展示寄生虫的形态学特征，本研究描述了一种新方法，结合了眶后注射荧光试剂、免疫荧光染色和组织透明化处理，以推动本领域的研究进展。

与小鼠视网膜组织在透明化前的状态相比，经过组织透明化处理后，以荧光番茄凝集素和PDGFR-beta标记的血管和寄生虫的背景信号显著降低，有助于更精确地观察它们的空间关系。

我们的结果表明，这些技术在整体视网膜的视网膜血管系统中显示寄生虫方面具有高度兼容性。结合这些组织学技术是从三维视角详细观察寄生虫形态特征的有效方法。

[讲师] 首先，将麻醉后的小鼠置于右侧卧位，头部朝向左侧。用两根手指轻轻按压眼眶周围区域，以暴露小鼠的左眼。使用配备27号针头的1毫升注射器，以针尖斜面朝前、与水平面呈45度角的方向，轻轻刺入眼眶静脉窦约2至3毫米。向眼眶静脉窦内注射0.1毫升荧光番茄凝集素（fluorescent tomato lectin）。在进行眼眶后注射5分钟后，处死小鼠，并用手术剪打开胸腔。将24号针头从左心室心尖处插入左心室约2毫米。以每分钟3毫升的速度，先用20毫升0.9%生理盐水进行灌注，随后再用20毫升4%多聚甲醛生理盐水溶液灌注。注射0.1毫升溶于0.1摩尔磷酸盐缓冲液中的0.9%甲醛溶液。接下来，将已处死的小鼠侧放，用剪刀去除覆盖眼睛的皮肤。使用剪刀和镊子摘除眼球。剪断视神经及周围组织，取出眼球。将眼球转移至12孔板中，用含4%多聚甲醛的0.1摩尔磷酸盐缓冲液固定2小时。固定完成后，将眼球置于含25%蔗糖的0.1摩尔磷酸盐缓冲液中，在4°C条件下进行冷冻保护处理，直至眼球沉入溶液底部。使用塑料移液枪头将眼球转移至含有0.1摩尔磷酸盐缓冲液的培养皿中。用尖头剪刀刺破角膜边缘，沿角膜和虹膜周围剪开并弃去。用镊子取出晶状体和玻璃体。然后，用精细镊子从眼球中心将杯状视网膜轻轻剥离。在洁净的培养皿中用0.1摩尔磷酸盐缓冲液冲洗视网膜。在分离出杯状小鼠视网膜后，将其置于含2% Triton X-100的0.1摩尔磷酸盐缓冲液中，在4°C条件下孵育20小时，过夜。第二天，将视网膜转移至封闭液中，在摇床上以72转/分钟的速度于4°C旋转过夜。随后，将视网膜放入含有稀释缓冲液配制的山羊抗PDGFRβ一抗的微量离心管中。将离心管置于4°C摇床上旋转孵育两天。两天后，在室温下用洗涤缓冲液清洗视网膜两次。将视网膜置于洗涤缓冲液中，转移至摇床上在4°C条件下继续旋转过夜。第二天，将视网膜转移至含有二抗溶液的微量离心管中，该溶液包含1毫克/毫升驴抗山羊IgG 488荧光抗体和0.2纳克/毫升荧光核染料DAPI。将离心管在4°C条件下于摇床上以72转/分钟旋转5小时。在六孔板中用洗涤缓冲液于室温下清洗视网膜两次，每次1小时。随后在摇床上用洗涤缓冲液于4°C条件下孵育过夜。第二天，将视网膜转移至组织透明化试剂中，在37°C、60转/分钟的摇床上轻轻旋转1小时。组织透明化处理后，在洁净的培养皿中用0.1摩尔磷酸盐缓冲液冲洗视网膜。使用弹簧剪刀在视网膜上做四个呈放射状的切口，切口长度约为视网膜半径的2/3，形成花瓣状。将视网膜展平，并将其内侧朝上固定在载玻片上。用一小块吸水纸吸除多余的磷酸盐缓冲液。用间隔圈围绕固定好的视网膜。在间隙中加入新鲜的组织透明化试剂，盖上盖玻片。使用全景组织切片扫描仪扫描标记后的视网膜拼接图像。使用配备数值孔径分别为0.40和0.95的2倍和10倍物镜的成像系统获取更高倍数的图像。从标记的视网膜中以每层2微米的步长采集50层Z轴堆栈图像。依次点击“设置起始焦平面”、“设置终止焦平面”、“设置步长”、“选择深度模式”、“图像采集”和“Z轴序列”，利用投影和地形图模式将所有图像整合为一张清晰的全焦图像。接下来，分别在499和519纳米处采集绿色荧光图像，在591和618纳米处采集红色荧光图像，在401和421纳米处采集蓝色荧光图像。依次选择“添加新表面”、“选择体积设置”、“选择源通道”、“调整显示”、“调整表面角度”和“快照”，将Z轴堆栈共聚焦图像导入分析软件，并以三维模式重建图像。经组织透明化处理后，整体封片视网膜的组织透明度较未经透明化处理的视网膜显著提高。使用番茄凝集素标记的视网膜血管以及使用PDGFR-β标记的视网膜寄生细胞在透明化前后均可观察到，但透明化后背景噪声明显降低。视网膜寄生细胞沿血管树分布，呈现出从视网膜中央区向周边区逐渐过渡的分布模式。来自透明化视网膜的三维Z轴堆栈图像显示，寄生细胞紧密包裹在不同直径的视网膜血管周围，且在毛细血管中PDGFR-β染色更强。