体外研究宿主-病原体相互作用的类器官组织模型系统 In Vitro

牙菌斑生物膜由数百种微生物组成，可引发口腔上皮的炎症反应，导致牙龈炎等疾病。我们希望利用类器官组织模型更深入地理解这些相互作用。这类系统为以受控方式评估替代治疗方案提供了有用的平台。

近年来，测序技术的进步正在变革感染生物学领域。这些技术使我们能够利用多种组学方法，通过在蛋白质组、转录组和代谢组水平上评估宿主与微生物的特征，深入研究宿主-病原体相互作用。我们近期的研究强调了在生物膜相关感染中跨物种及多微生物相互作用的重要性。

通过使用体外模型系统，我们能够研究宿主与生物膜之间的相互作用，测试新型抗生物膜治疗方法，并利用RAM和光谱学等创新技术对微生物群落进行分析。未来的研究将利用这些类器官组织模型，旨在同时实现对微生物、宿主组织及培养物的多组学特征解析与全面表征。我们希望在生物膜模型中揭示并解析宿主与特定细菌及真菌物种之间复杂的相互作用关系。

首先，从 -80 °C 条件下取出含有链球菌属的冷冻多孔珠。在含有 5% 无菌去纤维马血的哥伦比亚血琼脂平板上复苏链球菌属。将平板置于 37 °C、5% 二氧化碳环境中培养 24 小时。

第二天，从平板上转移三到四个菌落至10毫升胰蛋白胨大豆肉汤培养基中。在37°C和5%二氧化碳条件下培养肉汤16至18小时。培养后，在20°C下以3,000 ×g离心细胞悬液5分钟。

用10毫升无菌PBS洗涤细胞沉淀。将沉淀重悬于10毫升PBS中，并使用分光光度计在550纳米波长下分别对每种链球菌悬液进行标准化。标准化后，将每种链球菌悬液按1:10比例稀释，使其浓度达到每毫升1×10⁷个细胞，稀释液为Todd Hewitt肉汤与Roswell Park Memorial Institute培养基按1:1混合的溶液。

用移液器将500微升稀释后的细胞悬液加入含有13毫米羟基磷灰石圆片的24孔微孔板中。在37摄氏度、5%二氧化碳条件下培养24小时，以促进生物膜形成。以类似方式，在含5%无菌去纤维马血的专性厌氧琼脂基础培养基上培养厌氧微生物。

将每种厌氧微生物调整至特定的吸光度，并用等体积混合的Todd Hewitt肉汤和罗斯威尔公园纪念研究所培养基进行稀释。在链球菌生物膜成熟后，小心移除各孔中未黏附的细胞和用过的培养基。向每个孔中加入500微升浓度为每毫升一亿个细胞的四种厌氧微生物标准悬浮液。

在37摄氏度的厌氧条件下孵育生物膜24小时。第二天，从孔中移除非黏附细胞和用过的培养基。加入500 µL无菌的Todd Hewitt肉汤与Roswell Park Memorial Institute培养基1:1混合液。

在厌氧条件下培养生物膜24小时。第7天，用500 µL无菌PBS洗涤生物膜两次，用于共培养。首先，打开包装并将人源口腔上皮（HOE）组织及其培养基转移至II级生物安全柜中。

向12孔板的每个孔中加入1毫升随组织提供的维持培养基。使用无菌镊子，从营养螺杆和24孔运输板中取出含有HOE组织的聚碳酸酯插件，并将组织转移至已准备好的12孔板中。

将组织模型在 37 摄氏度、5% 二氧化碳条件下孵育 24 小时，以使其适应实验室环境。同时，为去除羟基磷灰石圆片上的生物膜，使用 19 号针头和镊子将圆片从 24 孔板底部取出，转移至含有 1 毫升无菌 DPBS 的 Bijou 管中。

将圆片置于超声水浴中，在35千赫兹条件下超声处理10分钟。完成适应后，使用镊子从12孔板中取出组织插入物。用移液器直接将100微升生物膜超声悬浮液加到组织模型上。

将插入物转移至另一含有1毫升新鲜维持培养基的12孔板中。在37摄氏度和5%二氧化碳条件下孵育组织模型24小时。进行组织处理时，在2毫升带螺帽和O形圈的离心管中准备350微升RLT裂解缓冲液，其中含1%β-巯基乙醇。

向离心管中加入约 100 微升 0.5 毫米的酸洗玻璃珠。使用镊子将含有组织的插入物从培养基中取出，并弃去插入物中残留的微生物悬液。将插入物倒置至与视线齐平，然后使用 19 号针头小心地从插入物底部切下组织和膜。

将组织和膜转移至预装的RLT缓冲液中。使用台式珠磨匀浆机匀浆组织30秒。根据生产商说明书提供的RNA提取试剂盒，从所得裂解液中提取RNA。

收集剩余的用过的组织培养基，用于采用低通量和高通量方法进行蛋白质组学分析。与未刺激的对照组相比，HOE 组织中炎症生物标志物的基因表达在暴露于生物膜裂解液后显著上调。其中，CCL2、CXCL1 和 CSF3 的变化倍数最大。

与对照组织相比，经生物膜超声破碎液刺激后，HOE组织中IL8 mRNA的表达水平升高了8.67倍。在培养上清中，IL8蛋白水平从对照组组织的每毫升1.005纳克升高至生物膜超声破碎液刺激组组织的每毫升4.245纳克。