基于LED的 体外 用于评估细菌光动力失活中光激活分子的筛选方法

我的研究致力于探索黄烷化合物家族中多种天然和合成的分子，核心兴趣在于研究它们在紫外线光防护方面的生物活性，并评估其作为光动力治疗应用中光敏剂的潜力。我们研究团队最近的研究结果证实了基于氨基的黄烷染料具有光激活特性，使其成为一类有前景的新型光敏剂。这些化合物展现出进一步探索的重要潜力，为该领域的创新应用开辟了道路。

利用96孔微孔板和光源面板系统，我们可以在受控环境中对光敏剂进行高通量筛选，从而简化光动力治疗中不同候选物质的鉴定与比较。首先，从保存的菌种中将金黄色葡萄球菌接种至Müller-Hinton琼脂平板。将平板置于37°C条件下孵育24小时，以获得新鲜培养物。

从琼脂平板上挑取两到三个新鲜菌落，加入六毫升预先温育的无菌过滤磷酸盐缓冲液（PBS，pH 7.4）中稀释。将接种物在1,200转/分钟条件下涡旋振荡三至四个循环，以均质化样品，随后将三毫升均质后的接种物转移至一次性比色皿中。在600纳米处测定其光密度后，用PBS稀释样品，使其光密度调整至0.1。

将光敏剂化合物溶于适当的溶剂（如DMSO或PBS）中，配制储备液。用PBS稀释储备液以制备工作液，确保细菌培养基成分不会干扰光吸收。涡旋振荡工作液，以确保完全混匀。

首先，制备金黄色葡萄球菌悬液和光敏剂化合物工作溶液。准备两个独立的96孔板，一个用于光照组，另一个用于暗对照组。在每个孔板中，分别加入100 µL光敏剂溶液和100 µL细菌悬液。

用移液器将溶液混合5到10次。将培养板置于37°C下孵育30分钟，使光敏剂与细菌细胞相互作用。孵育结束后，从孵箱中取出培养板。

将其中一块培养板避光保存，作为暗对照。将另一块96孔板放置在矩形50瓦LED面板上方。在LED表面标记培养板的边缘位置，以确保在重复实验时放置位置的一致性。

将培养板置于LED光下照射约15分钟。使用另一块96孔板对样品进行系列稀释，包括对照组、未照射孔和照射孔。根据样品数量，向每孔加入180微升PBS。

从照射和未照射的培养板中每个孔吸取20微升等分试样，加入含有PBS的培养板的第一列中。使用多通道微量移液器，从第1孔到第6孔进行简单的连续稀释。将一个琼脂平板均分为六个相等区域，每个区域对应一种稀释液。

从每个孔中取10微升等分试样，点样到琼脂平板的相应区域。将平板孵育18至20小时。从孵箱中取出琼脂平板，确定适合进行菌落计数的区域。

在螺旋板的每个区域中，计数菌落形成单位的数量。可见光光谱范围在 400 至 700 纳米之间显示出三个明显的峰。在黑暗条件下，所有测试的花色素化合物均未表现出细胞毒性作用。

相比之下，在光照后，所测试的化合物导致金黄色葡萄球菌的存活率呈剂量依赖性下降，在6和12微摩尔浓度下观察到显著效果。