靶向癌细胞中非编码RNA之间合成致死相互作用的双重CRISPR干扰策略

我们的目标是系统性地识别并以治疗方式靶向癌症中关键的网络枢纽，重点关注非编码RNA。当前实验方法面临的挑战在于需要具备组合能力，以并行生成和筛选大量基因。我们致力于探索新途径，以发现新型的组合式非编码RNA靶点或可成药的结构，从而克服耐药性和治疗逃逸问题。

未来，我们将把这一概念验证工具应用于大规模组合文库筛选，可能结合体外和体内RNA结合蛋白进行研究。使用台盼蓝染料在血细胞计数板中开始计数Lenti-X 293T HEK细胞。每10厘米培养皿接种4×10⁶个Lenti-X 293T HEK细胞，培养至次日细胞融合度达到约80%。

从这一步开始，在二级实验室中操作。将500微升合适的转染培养基与转移载体、包膜质粒和pPAX2载体混合。室温下孵育混合物5分钟。

在另一个离心管中，将500微升低血清培养基与36微升浓度为1毫克/毫升的PEI试剂混合。室温孵育5分钟。将两种混合液合并，室温孵育15分钟。

现在小心地将混合物逐滴加入含有六毫升的细胞培养基中，并在5%二氧化碳条件下于37摄氏度孵育过夜。12至15小时后，使用血清移液管将培养基弃入可高压灭菌的废液瓶中。在将耗材（包括血清移液管和移液器吸头）丢弃至高压灭菌废液容器前，需先用消毒液冲洗。

使用新的移液管向转染后的细胞中加入五毫升新鲜 DMEM。为了收获慢病毒，在转染后 48 小时，用血清移液管将上清液转移至一个 50 毫升的离心管中。然后向细胞中加入 5 毫升新鲜培养基，并继续孵育 24 小时。

将试管置于冰箱中保存。孵育后，重复收集慢病毒，并与之前收集的样品混合。第三次收获后，将三次收获的上清液合并，并于4 °C保存，直至进行过滤和离心。

将合并的上清液在气溶胶密闭容器和适用于生物安全二级病原体的转子中，于4摄氏度下以500 × g离心5分钟，然后通过0.2微米无菌细胞培养级针筒滤器过滤上清液。使用截留分子量为100千道尔顿的离心过滤装置，在4摄氏度下以1000 × g浓缩过滤后的上清液至约500微升。将50至100微升的病毒分装样品于-80摄氏度保存，直至后续使用。

转导前一天，将501-mel细胞以每孔2 × 10⁵个细胞的密度接种于6孔板中，每孔终体积为2毫升。从此步骤开始，在二级生物安全实验室中操作。更换培养基为2毫升预热的DMEM，其中添加polybrene，终浓度为6 µg/mL。

将50微升制备好的SPD和SAD慢病毒同时逐滴加入细胞中。轻轻摇动培养板，并在37摄氏度、5%二氧化碳气氛中孵育。转导后16小时，使用血清移液管将培养基弃入可高压灭菌的瓶子中。

加入2毫升含有10微克/毫升杀稻瘟菌素（Blasticidin）和2微克/毫升嘌呤霉素（puromycin）的新鲜培养基。转导后两天重复更换培养基步骤，转导七天后在S1条件下处理转导细胞。转导七天后，将0.1 × 10⁵个稳定转染了SadCas9 KRAB和Sp-dCas9-KRAB的细胞接种至96孔板中，每孔加入100微升预热的DMEM培养基。

转导当天，将培养基更换为100微升预热的DMEM，其中添加聚凝胺至终浓度为6微克/毫升。向细胞中加入适当体积的慢病毒，然后将培养板放入培养箱孵育。16小时后，更换为含有Zeocin、Blasticidin和嘌呤霉素的新鲜培养基。

转导后第五天，按照制造商说明书使用细胞活力检测试剂盒进行发光检测。外周血分析证实，在转导的501-mel细胞中，SpdCas9和SadCas9融合蛋白成功表达。定量聚合酶链式反应分析显示，利用特异性向导RNA可有效敲低长链非编码RNA RP11和XLOC，但仅有XLOC-sa和RP11-sp组合能够同时抑制两个靶点。

使用 XLOC-sa 和 RP11-sp gRNA 配对对 RP11 和 XLOC 进行双重抑制后，与对照组相比，501-mel 细胞活力显著降低至 59%。