一种通过活细胞FRET显微镜和免疫荧光高效评估斑马鱼努南综合征早期模型中ERK活性调控的实验方案

我们构建斑马鱼复杂发育性疾病的模型，将患者测序数据与功能基因组学相联系，以支持变异解读以及临床前药物测试。尽管FRET传感器已有改进，但仍缺乏具有足够时空敏感性的稳健体内检测方法，用于检测Ras-MAPK信号通路的细微致病性变化。首先，将含有模制2%琼脂糖的定制显微注射板置于E3培养基中，并放置于工作平台上。

将受精的斑马鱼胚胎按适当的位置排列并固定在培养板的加样槽中，以限制其在显微注射过程中的移动。使用微量移液器向注射针头后部加载 2 µL 注射材料。根据显微注射装置上针头和胚胎的质量，调节压力和时间参数，以校准每次注射条件。

将溶液注射到斑马鱼胚胎的单细胞期。在受控的饲养条件下培养显微注射后的胚胎。在受精后三小时内清除任何呈现浑浊或退化迹象的卵。

受精后约4小时，使用标准荧光体视显微镜，在465至500纳米波长范围内观察胚胎的荧光报告基因表达。筛选出荧光阳性的幼鱼用于FRET成像，将阴性同胞幼鱼保留用于免疫组织化学分析。

将数量相等的胚胎分组放入六孔板的不同孔中。开始处理时，将胚胎浸入含有溶剂对照（DMSO）或稀释后的MEK（目标浓度）的3毫升E3培养基中。首先，在ThermoMixer中将1.5%至2%的低熔点琼脂糖 aliquot 在50摄氏度下融化。

溶解后，将温度降至约 30 摄氏度。将一枚注射过的 teen positive 胚胎置于 35 毫米玻璃底培养皿中央，用于活体成像。吸除多余的 E3 培养基，加入一滴低熔点琼脂糖以固定胚胎。

在室温下使琼脂糖聚合。在采集图像前至少一小时打开培养箱控制器，并将温度设置为28摄氏度，以维持胚胎的健康状态。待培养箱温度稳定后，将含有胚胎的成像培养皿放置在样品支架上，使用10倍干镜物镜观察样品。

打开氩离子激光器，并将激光功率调节至50%。在硬件设置中，选择8位深度分辨率以采集图像。接着，在采集面板中选择光谱检测xy、gamma、lambda、z扫描模式，设置图像格式为512×512像素，扫描速度为400赫兹，光学放大倍数为0.75。激活氩离子激光器的458纳米激光线，并将其强度值设为8.5%。然后选择混合探测器，并将其灵敏度设置为增益值500。

在检测器栏中打开下拉菜单，选择青色荧光蛋白或ECFP发射曲线。如需显示YPET发射曲线，请激活第二个检测器，然后选择黄色荧光蛋白YFP发射曲线。

开始实时采集时，将检测光标置于YFP信号最强的范围内以观察样品。在Z-Stack LASX窗口中设置样品厚度的起始和终止位置。将伽马扫描范围的检测属性设置为从460纳米开始，至570纳米结束。

将检测带宽定义为5纳米，扫描步长设为5纳米。开始z轴层扫描采集。在配置窗口的染料数据库中插入并保存CFP和YFP的两种经调整的参考发射光谱，以排除光谱串扰。

从成像会话中选择生成的光谱图像文件，并打开处理窗口。接着，在染料分离工具中选择光谱染料分离，并配置染料分离的设置。在对话框左侧的下拉列表中，第一个位置选择新的CFP发射光谱，从光谱数据库中选择新的YFP发射光谱。

在图像的伽马扫描中，确定信号强度最大的图像。然后沿 z 轴扫描选择光学切片，以突出显示边缘区感兴趣区域。在动物极的边缘区激活 ROI 选择模式，以定义具有最佳光谱的区域。

在显示窗口中单击 ROI 十字准线，并在测量区域将参考 ROI 的大小调整为 40 个体素。打开新生成的包含两个分离通道的文件。使用最大强度投影法，从三维图像序列生成二维投影图像。

在“处理”窗口中，选择裁剪以将通道分离为两个独立的文件，即通道一和通道二。在“处理”窗口中，选择“合并图像”，然后选择通道二文件并将其插入第一个选项中。接着选择通道一文件并将其插入第二个选项中。

设置一个缩放因子为五的重缩放，并选择比值运算。单击“应用”以生成包含比值度量图像的新文件。保存该文件以进行数据分析。

将光谱成像和染料分离的图像文件导入开源的 Fiji 软件进行分析。在 Fiji 中使用“分析”和“设置测量”功能来配置读数测量参数。选择面积、积分密度和平均灰度值作为感兴趣的参数。

使用工具栏中的多边形选择工具，选中与原肠胚边缘相对应的兴趣区域。依次点击分析、工具和ROI管理器，以保存该ROI的xy坐标信息。如需对选定的ROI进行测量，请点击分析并选择测量。

在工作表中按实验分组列排列每个 ROI 的 CFP 比值 FRET 值，原始数据以行排列。对于单个生物学重复，创建一个包含一个分组变量的列联表，每组由一列定义。在原肠胚形成结束时，将胚胎浸入用 PBS 配制的 4% 多聚甲醛中，在室温下固定 20 分钟。

固定后，用 PBS 多次洗涤胚胎。使用移液枪将胚胎置于含有新鲜 PBS 的 12 孔板的一个孔中，并使其呈侧向排列。使用体视显微镜，配备 2.7 倍放大倍率的物镜、0.63 倍扫描物镜和 8.6 倍变焦系数，在明场模式下采集图像，以评估是否存在椭圆形结构。

将捕获的胚胎图像导入 Fiji 软件。为测量胚胎各轴的长度，从工具栏中选择直线工具，然后点击分析，接着选择测量。完成选定的测量后，将其添加到 ROI 管理器列表中，并保存 ROI 文件。

将数据导出至工作表中。通过将长轴长度除以短轴长度来计算轴长比。计算不同重复组的平均值、平均值的标准偏差或平均值的标准误差。

我们在斑马鱼中建立的活体FRET检测流程能够早期敏感地检测致病性ERK信号通路的激活，有助于基因变异的功能解析以及MEK抑制剂疗效的测试。