单核苷酸多态性敏感的FISH检测法用于果蝇（Drosophila melanogaster）位点特异性核糖体RNA转录的检测

我们的研究重点是理解细胞如何感知、监测和调控其基因组内的多个核糖体DNA位点。具体而言，我们旨在揭示区分哪些rDNA位点处于活跃转录状态的机制，以及这些位点如何受到独立调控。我们最近发现，细胞内的rDNA数量会随时间发生变化，而这种变化会影响哪些rDNA位点被转录。

现在我们了解到，细胞会根据其核糖体DNA（rDNA）的数量来改变rDNA的转录。这一发现促使我们提出新的问题：细胞是如何感知自身rDNA的数量，以及如何决定优先表达哪一个rDNA位点的？目前，我们的实验室正致力于研究细胞用于区分不同rDNA位点并感知与调控其活性的分子机制。

在体视显微镜下，将果蝇解剖以在无RNase的PBS中分离睾丸。操作开始时，用一对镊子夹住腹部中段，另一对镊子夹住腹部末端，轻轻将果蝇身体拉开。使用镊子将分离出的睾丸从解剖皿转移至含有0.5毫升无RNase PBS的1.5毫升微量离心管中。

吸去 PBS，加入一毫升固定液。将样品置于室温下的旋转摇床中孵育 30 分钟。孵育结束后，吸去固定液。

然后在旋转摇床中用一毫升 PBS 洗涤样品两次，每次五分钟。吸除 PBS 后，向样品中加入一毫升无 RNase 的 70% 乙醇，并在 4°C 下于旋转摇床中孵育过夜。接着吸除乙醇，并向样品中加入一毫升洗涤缓冲液。

将样品在室温下置于旋转摇床中孵育3分钟。随后，将离心管直立静置2分钟。将探针和封闭剂与杂交缓冲液混合，按每份样品100 µL的总体积进行配制，如下所示。

吸去洗涤缓冲液后，向样本中加入100微升杂交溶液。用透明薄膜密封管子的管口边缘。用铝箔纸包裹管子以避光，并将样本置于37摄氏度水浴中孵育至少24小时。

不吸取杂交液，直接向样品中加入一毫升洗涤缓冲液。将样品置于37摄氏度水浴中避光孵育30分钟。吸去洗涤缓冲液后，向样品中加入一毫升新鲜洗涤缓冲液，再次孵育。

孵育结束后，吸去洗涤缓冲液，并向样品中加入 50 µL 封片介质。在解剖体视显微镜下，使用移液器将样品转移至显微镜载玻片上。用镊子将睾丸在载玻片上排列成一行，以便成像时便于识别样品。

用盖玻片覆盖样品，并用纸巾轻轻擦拭盖玻片边缘，去除多余的封片介质。用指甲油密封盖玻片边缘，置于室温避光处静置10分钟，使指甲油完全干燥。rRNA信号出现在核仁中，表现为细胞核内的DAPI透亮区域，尤其在细胞核和核仁较大的生殖细胞中更为明显。

在缺乏rRNA基因座的样本中，细胞质内观察到微弱且非特异性的信号。在大多数细胞中，仅检测到YrRNA信号，表明rRNA转录来自YrDNA基因座。在生殖细胞中观察到X与YrRNA的共表达，信号或融合为单个细胞核，或分离为两个核仁。