调控基于肌动蛋白的活性组装体的收缩性与变形模式 体外从二维活性网络到液晶液滴

本研究聚焦于软性生物材料，旨在探索调控形态与组织结构的内在物理机制，以及受生物细胞启发的材料。

生物和体外模型系统本身具有高度复杂性，并存在诸多潜在问题，而样品制备对这些系统的可重复性至关重要。本方案旨在提高这些系统的可重复性。

这些结果为检测、表征物理力和生物材料的机制并理解其功能奠定了基础。该方法可推广至多种生物大分子和细胞器。

[旁白] 首先，准备待上样样品：在微量离心管中加入5微升10×缓冲液，并加入适量去离子蒸馏水，使得在加入其余组分后最终样品体积为50微升。用移液器加入1微升25% β-巯基乙醇、1微升225毫克/毫升葡萄糖、1微升葡萄糖氧化酶与85,000单位/毫升催化剂的混合物至溶液中。然后加入1微升25毫摩尔ATP和10微升2%、15厘泊的甲基纤维素，通过反复吹打充分混匀。为启动肌动蛋白聚合，将未标记肌动蛋白与标记肌动蛋白混合，并将肌动蛋白混合物加入已准备好的F缓冲液中。上下吹打溶液以确保充分混匀。将肌动蛋白置于微量离心管中，在室温下静置进行聚合。接下来，准备流动池：将两段双面胶带平行地贴在显微镜载玻片的宽度方向上，形成流动池通道的边界。将盖玻片置于胶带形成的通道上方，确保其与载玻片垂直。按压盖玻片与双面胶带接触的区域，以形成良好密封并消除气泡。使用剃刀刀片修剪载玻片和盖玻片上多余的胶带，使仅在样品通道内可见胶带。为制备用于两个去平面样品的圆柱形样品室，首先用乙醇、水和乙醇依次冲洗盖玻片，并用过滤空气干燥。在盖玻片上涂一层薄薄的5分钟环氧树脂，用于将玻璃克隆圆柱体粘附于其上。向透明或浅色微量离心管中加入3.5微升油性表面活性剂溶液。不进行混合，直接将5微升肌动蛋白溶液通过移液器加至油性表面活性剂层的顶部。盖紧管盖。握住微量离心管顶部，轻弹底部边缘，形成初始泡沫并出现可见乳液，持续轻弹直至形成均匀的微乳液。在上样前，先混合少量5分钟环氧树脂。为上样流动池，将1至3微升油性表面活性剂溶液移入流动池的样品通道中，形成润湿通道的小液塞。倾斜流动池，以去除因油性表面活性剂弯月面回缩而形成的气隙，然后再加入样品。立即通过移液将样品溶液乳液悬液加入流动池入口，以填充通道。用5分钟环氧树脂密封流动池通道的两端。为非乳液样品的圆柱形样品室上样，将5微升油性表面活性剂溶液移入玻璃圆柱室底部。倾斜并缓慢旋转盖玻片，使表面活性剂溶液覆盖表面及圆柱内壁。用移液器吸除多余的油性表面活性剂溶液，保留一层薄层，同时防止油完全蒸发。立即向样品室中加入样品溶液。用一小片聚四氟乙烯（PTFE）胶带覆盖样品室，以防止蒸发和液体流动。将样品安装至显微镜载物台上。使用20倍、40倍、60倍或100倍油浸或水浸物镜开始肌动蛋白的时间序列成像，确保具有足够高的数值孔径以实现高分辨率成像。若在样品室中进行聚合，需让聚合持续约30分钟，或直至无可见的丝状结构延长或运动为止。向样品中加入交联剂，然后缓慢移取约总体积一半的肌球蛋白预聚合丝状物加入样品中。最后，开始时间序列成像。此处显示的是缠结肌动蛋白网络的代表性共聚焦荧光图像。该缠结的肌动蛋白网络在表面均匀分布。图像中的亮斑代表丝状结构的重叠区域，而暗区则表示肌动蛋白含量极少。热波动导致局部荧光强度变化及肌动蛋白丝的可见弯曲。加入肌球蛋白II后，肌动蛋白网络发生弯曲和重组，并在较长时间后可见肌球蛋白点状聚集。网络收缩程度取决于肌球蛋白浓度和ATP浓度。在交联的肌动蛋白网络中，肌球蛋白诱导的收缩导致比缠结网络更长尺度上的协调运动。