使用壳聚糖纳米颗粒包裹的腺嘌呤碱基编辑器质粒进行骨内注射以增强基因递送与表达

我们提出一种基因治疗方法，通过骨内注射将基于腺嘌呤的编辑器壳聚糖直接递送至骨髓。外源质粒在实验动物中的转染效率相对较低，且长期基因表达所需的质粒引入可能受到免疫系统的影响。我们利用壳聚糖包裹基于腺嘌呤的编辑器质粒，并通过骨内注射将该复合物直接递送至小鼠骨髓，使其适用于由破骨细胞功能异常引起的疾病。

本方案具有高转染效率、低生物损伤以及高基因表达效率的优点。我们的新策略不仅适用于由破骨细胞功能异常引起的疾病，而且在推动基因治疗领域发展方面具有重要意义。首先，将已处死的小鼠置于工作台面上。

使用手术剪和镊子取出胫骨，并剥离所有周围肌肉组织。将清理后的胫骨浸泡在磷酸盐缓冲液（PBS）中，清洗至仅剩骨组织。用注射器吸取一毫升 PBS，从胫骨一端冲洗骨髓细胞，直至骨骼完全变为白色。

接下来，将细胞悬液收集到离心管中。在4°C条件下以800 G离心5分钟。吸去上清液后，向沉淀中加入500微升红细胞裂解缓冲液。

一分钟后，加入一毫升裂解终止缓冲液以终止裂解反应。将悬浮液在4°C条件下以800 G离心五分钟。弃去上清液，将所得的细胞沉淀置于冰上，留待后续使用。

进行壳聚糖转染时，将四毫克壳聚糖溶解于20毫升乙酸溶液中，使用10摩尔氢氧化钠调节pH至5.5。然后将500微升壳聚糖溶液分装至各个微量离心管中。

现在将两、三、四和五微克的ABE质粒分别加入不同的离心管中。用500微升30毫摩尔的硫酸钠溶液溶解质粒。然后在相应的离心管中，将500微升质粒溶液与500微升壳聚糖溶液混合。

将试管置于50至55摄氏度的水浴中孵育15分钟。每支试管涡旋15至30秒，然后静置30分钟，避免扰动。为进行表征，采用动态光散射法分析壳聚糖的粒径和ζ电位。

将壳聚糖的浓度维持在双蒸水中的0.1毫克/毫升。接下来，将0.1毫克/毫升的壳聚糖样品滴加到硅片上。将20微升重悬的样品加入200目网格中，并进行孵育。

在4°C条件下，以800 G离心骨髓细胞悬液5分钟。弃去上清液，加入500 µL红细胞裂解液。1分钟后，加入1 mL分离缓冲液以终止反应。

然后使用细胞计数器对细胞数量进行计数。接着，将100万个细胞转移至新的微量离心管中。再次离心后，用移液器吸去上清液，并将细胞重悬于500 µL的PBS中。

将重悬的细胞转移至流式细胞管中，通过流式细胞术检测转染效率。进行骨髓腔注射时，将麻醉小鼠仰卧位固定于手术台上，使用胶带固定前肢。

使用酒精棉片消毒胫骨后部。然后将质粒溶液吸入一支配有26号针头的1毫升注射器中。排除所有气泡，并将注射器准备好以备注射。

接下来，用手指触碰并固定小鼠的胫骨。将注射针置于靠近膝关节的胫骨平台处，使其进入胫骨干。然后将针头旋转至与胫骨平行，插入骨髓腔，并在三秒内缓慢注射。

注射后，缓慢拔出针头，持续约三秒钟。立即使用酒精棉片对穿刺部位进行消毒，以止住任何出血。将小鼠置于37摄氏度的温暖环境中，以促进其恢复。

由ABE和GRNA质粒形成的纳米颗粒具有均匀的球形形态和较窄的粒径分布，平均粒径为202.9纳米。其Zeta电位为2.77毫伏，多分散指数为0.22。壳聚糖包埋的ABE质粒显著增强了骨髓细胞中的荧光信号，表明与对照组相比，转染效率更高。

流式细胞术证实，编码ABE质粒的壳聚糖在骨髓细胞中实现了高效的转染。在四微克剂量下，最高转染效率达到51.2%；而三微克剂量则在47.2%的高效率下达到最佳平衡。对骨髓细胞基因组DNA进行的Sanger测序和PCR分析显示，在靶点A1位点的体内基因编辑效率为14.27%，在A2位点的编辑效率为10.69%。