发育和成熟胚乳细胞层显微分析用完整组织的制备 拟南芥 种子

我们的研究领域之一是种子科学。我们旨在解答胚乳如何影响种子萌发这一科学问题。一种名为种子生长抑制试验的体外检测方法，揭示了胚乳在种子萌发过程中的生理重要性。拟南芥种子非常微小，其胚乳细胞层位于种皮（testa）下方，即细胞内部。在不进行化学固定的条件下制备胚乳样品具有较大挑战性。以往对胚乳的研究分析均采用化学固定的样品，因此无法观察活体蛋白的动态变化。本实验方案可实现对胚乳细胞动态过程的五维细胞成像。该方案仅需使用常规实验室设备，即可深入探究胚乳细胞间的细胞事件、分子机制及其正常功能。

[旁白] 首先将拟南芥植株种植于土壤或岩棉中，直至开花阶段。用彩色线标记完全开放的花朵，以指示开花后零天。选择开花后12至16天的角果用于下一步操作。使用精细剪刀在果柄处剪下标记的发育中角果，并将其收集到1.5毫升离心管中。准备湿润的滤纸用于解剖，以防止样品干燥，并将样本置于体视显微镜下。使用两把镊子，一把尖端较粗用于固定，另一把尖端尖锐用于撕开。从果瓣与果柄连接处（replum）分离出一个果瓣。然后使用闭合尖端的镊子，轻柔地从角果中夹取发育中的种子，避免损伤。使用27号注射针头，在包围胚的种皮（testa）和胚乳（endosperm）上制造一个约0.1至0.2毫米大小的切口。用镊子夹住种子，注意不要压碎，并在子叶与胚根交界处进行划痕。接着，用镊子轻轻挤压种子，将胚推出，注意不要压碎空的种皮囊，并保持其圆形形态。将注射针头从切口插入空的种皮囊内，并由内向外穿刺。随后保持针头位置不动，用闭合尖端的镊子刮擦种皮表面。然后剪开种皮囊的一侧，使其能够展开。现在使用尖头镊子将种皮囊展开成片状。分离后的样品应为由胚乳和种皮组成的双层片状结构。将干燥的拟南芥种子放入1.5毫升离心管中，加入1毫升双蒸水。在室温下浸泡种子至少40分钟。在体视显微镜载物台上准备一张湿润的滤纸用于解剖，使用1000微升移液器将吸胀后的种子转移至湿润滤纸上。将样品置于体视显微镜下观察。使用注射针头在包围胚的种皮和胚乳上制造一个约0.2毫米大小的切口。用镊子夹住种子，避免压碎，并在子叶与胚根交界处进行划痕。随后用镊子轻压种子，将胚推出。避免压碎空的种皮囊，保持其圆形形态。使用注射针头切割空种皮囊的上下两侧，将其塑造成圆柱形。接着沿圆柱形种皮囊的中心轴剪开，将其分为两部分。最终应得到由胚乳和种皮组成的双层片状结构。将分离出的胚乳样品以片状置于载玻片上，并用水封片。最后，轻轻盖上盖玻片，确保胚乳层朝上贴近盖玻片。使用指甲油或封片胶密封盖玻片边缘，防止干燥，然后在显微镜下观察样品。利用既定的制备方案，成功观察到开花后14天收获种子中的大量胚乳细胞及其细胞内结构。在白光条件下，表达PHYB-GFP的胚乳细胞核内检测到光体（photo bodies），证实其存在及核内定位。在交替红光与远红光照射下，胚乳细胞表现出可逆的光体形成，证实PHYB具有光可逆性及生物学活性，至少可持续至解剖后4.5小时。对种子抑制3小时后完整胚乳细胞中的线粒体进行荧光延时成像，检测到线粒体运动。在种子抑制1天后，胚乳细胞中观察到更活跃的线粒体运动，表明其活性随时间逐渐增强。