基于GFP互补的双表达系统用于活体评估由细胞突起介导的细胞间接触 果蝇 翅成虫盘

因此，我们的研究重点是理解组织中相距较远的细胞如何相互交流。我们以果蝇翅成虫盘作为模型系统，试图阐明细胞突起（cytoneme）的形成机制、功能及其在局部调控组织生长中所起的作用。研究表明，生长因子通常通过一种基于肌动蛋白的特殊细胞突起——即称为细胞丝状伪足（cytoneme）的信号传递结构——传递至靶细胞。

细胞突起是非常纤细且脆弱的结构，容易受到固定方案的破坏。为了观察它们，需要使用表达荧光标记蛋白的专用活体成像方法。这极大地限制了我们可用于研究它们的工具和方法。

我们鉴定出一种称为Slik的蛋白激酶，其参与了细胞突起（cytoneme）的生成。在翅成虫盘的某一上皮层中表达Slik，可触发形成跨越成虫盘腔的细胞突起，并促进邻近上皮层细胞的增殖。未来，我们希望鉴定出在Slik下游发挥作用以促进细胞突起形成的蛋白，鉴定通过该细胞突起传递以促进增殖的配体，并进一步阐明该机制在调控组织生长中的生理意义。

首先，使用剪刀从八联排管中剪下单个孔，并将每个孔剪成两半。移除每半边一侧的保护背衬，然后将间隔物粘贴到显微镜载玻片上，间隔物之间稍留间距，以形成一个用于放置组织块的中央庇护空间。在完成遗传杂交并经25°C培养后，从培养管中挑选出爬行的三龄幼虫。

在解剖显微镜下，将幼虫转移至涂有硅胶的培养皿中的一滴活体成像培养基内。使用两把解剖镊子，用其中一把镊子夹住幼虫头部起约三分之一体长处以固定幼虫；用另一把镊子在第一夹点稍后方夹住虫体，向后拉扯，分离后半部分，从而分离出前段组织。

用镊子夹住切口端的两侧，再用另一对镊子将头部推入，使前半部分翻转，内外翻出。这样可暴露内部结构，如成虫盘、气管、唾液腺、脂肪体和肠道。用镊子去除唾液腺、脂肪体和肠道，注意不要扰动覆盖在翅盘上的侧支气管主干。

用镊子将带有附着翅盘的清洁前半部分转移至一滴清洁的活体成像培养基中，将钩子置于载玻片间隔物之间。为分离翅盘，用解剖镊子的一侧刀刃或安装在解剖针持针器上的细钨丝，小心地将其从细微的气管分支中解剖下来。弃去剩余的尸体组织。

使用解剖镊尖端或钨针将翅成虫盘调整至周围膜一侧朝上。调节培养基体积，使其略微高于隔片水平并充满小孔。取下成像隔片的顶部保护背衬，然后轻轻将盖玻片覆盖在样品上。

使用镊子的圆头按压盖玻片在间隔物的接触点处，以确保充分粘附。在 ImageJ 中投影图像堆栈时，依次选择图像（Image）、堆栈（Stacks）、Z 投影（Z Project），然后从菜单中选择最大强度投影（Maximum Intensity）。在最大强度投影图像中，根据钩状结构通道的翅盘折叠模式，结合多边形选区工具，确定翅囊区域。

对GFP通道应用相同的选区，然后依次选择“编辑”和“清除外部”，以消除选中区域外的噪声。利用最大强度投影图像中的hooks通道来识别GFP图像中的伪影斑点。随后，使用多边形选区工具选择该区域。

单击编辑并选择清除。在经过清理的最大强度投影图像中，选择分析，然后选择直方图，并点击列表以获取所有像素值。将此列表复制到电子表格中。

为设定阈值，需分析阴性对照样本中的背景信号，并利用其他样本图像验证该数值。通过将高于阈值的像素数量除以有效像素总数，再将结果乘以 100，计算出 GFP 阳性表面所占的百分比。最后，将每个计算得到的数值除以参照条件的平均值（设定为 1）进行归一化处理。

在缺乏两种split GFP组分的野生型碟状体中，仅在翅囊中央附近观察到微弱的颗粒状GFP自发荧光，该基础信号被用于确定荧光阈值。仅在碟状体适当层表达CD4 split GFP1-10的碟状体，其荧光水平与野生型无差异，证实了GFP1-10单独存在时不具有荧光特性。当在碟状体适当层表达CD4 split GFP1-10的同时，在周膜层表达CD4spGFP11时，可在碟状体腔内观察到明显增多的离散而明亮的GFP荧光点，其超过阈值的荧光阳性区域显著大于对照组。

Slik 在碟状区域的表达导致周膜细胞核密度显著增加，并在整个翅囊区域中 GFP 信号强度急剧上升，表明由 Slik 诱导的细胞质丝状突起增强了与周膜细胞的接触。