活体成像与特征分析疾病小鼠视网膜中小胶质细胞动态及其与突触的相互作用

本实验室的研究范围是探讨青光眼以及小胶质细胞在发育过程中突触重塑的潜在机制。当前的实验挑战主要集中在小胶质细胞究竟是主动拆解视网膜神经节细胞的突触，还是仅仅被动地清除碎片。开始实验时，将小鼠视网膜置于滤纸上，并用实验室擦拭纸将其干燥。

将视网膜翻转至 MatTek 培养皿中，使用金属珠或环状物压住视网膜，然后加入三到五滴人工脑脊液。

将样品置于转盘共聚焦显微镜下，调整参数以预览视网膜。沿Z轴以0.3微米的步长，在10至20微米的总深度范围内采集图像。帧间时间间隔保持在20至30秒，以确保细胞追踪的可靠性。

为了对小胶质细胞进行表面渲染，使用文件转换软件将延时成像文件转换为 IMS 格式。根据先前获取的图像属性输入体素尺寸。在分析软件界面中，点击 observe 文件夹以打开已转换的文件，并确保图像处于 3D 视图状态。

为了检测单个小胶质细胞，点击对象工具栏中的“添加新表面”图标。在算法设置中选择仅分割感兴趣区域、随时间追踪表面、对表面进行分类以及对象-对象统计。然后，点击蓝色播放按钮继续操作。

选择用于表面渲染的通道。可选地，启用平滑以优化表面生成，并输入表面细节参数。在阈值设置下，选择机器学习分割以检测细胞。

在训练数据下，使用背景和前景画笔工具。通过选择所需的画笔并按住 Shift 键同时单击左键来绘制笔触。确保已启用插值显示，然后选择训练并进行预测。

使用中间的黄色指针在 Z 轴上进行导航。在 X、Y 和 Z 平面上以及多个时间帧内绘制多条轨迹。每次输入使用三到五条短轨迹，并逐步调整，直至生成准确的表面。

使用黄色矩形在训练显示与最终生成的实际表面之间进行切换，以进行最终核对。同时，检查在时间序列中该表面是否与细胞形态一致。完成后，取消选中分割的物体。

调整体素直方图阈值，以去除不属于主要表面的小型不连通对象。然后使用剪刀工具手动编辑表面，去除多余对象或裁剪边缘。如有需要，可设置允许间隙的阈值，并为运动细胞选择追踪算法。

筛选掉未与主表面相关联的轨迹对象。完成后，将运动细胞的显示模式设置为透明轮廓，以便在后续步骤中观察点状结构。为检测单个 PSD95 点状结构，请点击对象工具栏中的蓝色表面图标。

然后，随时间选择轨迹点，对点状结构进行分类，并进行对象-对象统计，然后点击播放。选择突触标记物的源通道。关闭切片器和其他通道，仅显示 PSD95。

使用控制按钮和指针选择工具估算点状结构的 XY 直径。选择几个在多帧图像中持续存在的明亮点状结构，并关闭背景减除。接着，根据斑点质量添加滤波器。

调整直方图，以包含所有时间帧中准确的 PSD95 簇状信号。通过编辑去除假阳性斑点。在立方体或圆形光标之间切换，删除仅持续一到两帧的斑点。

如有需要，可设置允许的缺口阈值，并选择用于突触斑点的追踪算法。通过直方图阈值过滤与真实 puncta 无关的斑点轨迹，以排除微小物体的轨迹。使用到表面的最短距离分类法来定义分类。

将吞噬定义为小于零微米的任意点状结构，接触定义为距表面约0至0.5微米，未接触定义为0.5微米以上。使用上述分类对事件进行标签标注。当表面和点状结构已准确代表小胶质细胞和点状物后，在“统计”选项卡下导出所有统计数据。

与对照组相比，激光诱导眼压升高后，小胶质细胞的突起移动距离增加。激光处理眼中小胶质细胞的运动速度显著高于对照组。激光处理后，小胶质细胞与PSD95 puncta之间的接触事件数量增加。

延时记录显示，与对照组视网膜相比，经激光处理的视网膜表现出更强的微胶质细胞运动性，并且与PSD95 puncta的相互作用增加。我们的关键研究结果表明，在小鼠眼压短暂升高后，微胶质细胞的数量、复杂性及运动性均有所增加，并伴有突触共定位现象。本实验方案采用离体成像，有助于避免白内障和角膜混浊等问题，从而简化实验设置，加快实验进程，显著提高整体通量。

我们的研究通过利用转基因荧光品系以及高分辨率时间序列成像技术，实现了对小胶质细胞-神经元相互作用、细胞间通讯及动态过程的可视化，从而推动了相关领域的研究进展。