利用高通量方法评估叶片对微生物次级代谢产物的响应

我的实验室致力于植物与微生物互作的研究，最终目标是利用遗传学手段提高作物的抗病性。近期研究进展表明，微生物的次级代谢产物在促进植物感病性或抗性方面发挥着关键作用。首先，使用直径为四毫米的打孔器从每株植物上采集三个叶片圆片，注意避开主叶脉。

用尖端施加扭转动作，以防止组织软化。将次生代谢物或溶剂处理液按所需浓度加入96孔板的各个孔中，使最终体积达到200 µL。轻柔地将叶圆片放入各孔中。

将去盖的96孔板放入配备真空喷嘴的钟罩中。然后，将真空管连接至钟罩喷嘴，开启真空泵，调节压力为9.8磅每平方英寸，抽真空10秒。关闭真空泵，缓慢释放压力，持续10秒，随后重复一次真空循环。

将盖子重新盖回96孔板上，置于光源下，在轨道摇床上孵育。距离摇床23厘米处放置4小时。用超纯水清洗探针，并在无绒布上轻轻蘸干以干燥。

记录水的电导率读数以供后续参考。处理后四到六小时，将探头浸入叶圆片周围的液体中，测量并记录各孔的电导率。将培养板倾斜至45度角，以确保探头完全浸入。

在冲洗探针并如前所述进行演示后，偶尔测试水的电导率以确认探针的稳定性。然后，将一块塑料封膜覆盖在96孔板上，并将其放回摇床中过夜孵育。为配制过氧化物酶底物，将40毫升无菌蒸馏水加入含磁力搅拌子的烧杯中，加热至70摄氏度。

将50毫克5-氨基水杨酸溶于热水中。然后加入适量水，定容至50毫升，并用氢氧化钠调节pH至6。用铝箔包裹容器，以保护对光敏感的溶液。

在50毫升棕色锥形管中，用超纯水配制1%过氧化氢溶液。然后，每毫升检测体系所需的5-氨基水杨酸溶液中加入10微升1%过氧化氢溶液。在预定时间点，混匀5次，然后从样品板的每个孔中转移50微升至新板中。

加入 50 µL 检测培养基，在室温下孵育 3 分钟。为终止反应，向每孔中加入 20 µL 2 N 氢氧化钠，并使用酶标仪在 595 nm 处测定每孔的吸光度。水和 0.1% 二甲基亚砜产生的离子渗漏和过氧化物酶活性水平相似，表明它们可作为阴性对照。

使用1 µM FLG22处理显著诱导了离子渗漏、过氧化物酶活性和胼胝质积累，证实其作为强阳性对照的有效性。Gramillin处理显著诱导了离子渗漏和胼胝质积累，但对过氧化物酶活性的影响具有变异性。10 µM surfactin处理可诱导过氧化物酶活性和胼胝质积累，而离子渗漏保持不变。

T-2 毒素处理抑制了过氧化物酶活性，同时诱导了胼胝质的产生，但对离子渗漏无影响。我们的水培实验方法使研究人员能够在同一样本中检测三种不同的胁迫响应，从而最大限度地利用有限的微生物次级代谢产物。在同一块 96 孔板中比较 96 个样本的能力，使研究人员能够开展群体遗传学水平的筛选或系统生物学研究，以深入理解植物与微生物之间的相互作用。

我的研究将继续聚焦于植物与微生物的相互作用，并鉴定可用于培育谷类作物抗病性的植物基因。