体外 使用上皮类器官-T细胞共培养系统诱导组织驻留记忆性CD8 T细胞分化
2026年2月3日
研究CD8 T细胞的分化与功能 体外，可从 小鼠 中分离 CD8 T 细胞，并与已形成的感染性 小鼠 阴道上皮类器官进行长期共培养。本文描述了该过程，并评估共培养过程中组织驻留记忆 T 细胞标志物的获得情况。
本研究探讨女性生殖道中的CD8驻留记忆T细胞，分析感染和疾病如何影响其驻留特性、功能、维持机制及治疗潜力。现有方法在维持驻留记忆T细胞的存活和表型稳定性方面存在局限。本实验方案通过类器官与T细胞共培养诱导组织驻留状态，实现驻留记忆T细胞的可扩展性体外研究。
首先，在24孔板的每个孔中加入20微升基底膜提取物，接种密度为每孔10,000个细胞的阴道上皮类器官（VEOs）。将培养板放入培养箱中，在37摄氏度条件下培养7至10天。共培养前一天，吸除指定孔中的细胞培养基，并用DPBS清洗各孔。
吸除 DPBS，然后加入 600 µL 预热的 0.25% 胰蛋白酶 EDTA 溶液至孔中。使用经 BSA 包被的 P1000 移液器充分重悬，以机械方式破坏基底膜提取物，并将孔内液体转移至经 BSA 包被的无菌 15 mL 圆锥形离心管中。随后将该离心管置于 37 °C 水浴中。
五分钟后，加入10毫升含10% FBS的RPMI培养基以终止消化反应。随后将离心管放入离心机，在4°C条件下以500 × g离心五分钟，并弃去上清液。使用经BSA包被的移液枪头，将沉淀重悬于100至300微升T细胞类器官培养基或普通的DMEM/F12培养基中。
使用血细胞计数板对细胞进行计数。根据总细胞数和已知的病毒滴度，计算实现感染复数为0.1所需的病毒体积。吸除选定用于感染的VEO孔中的细胞培养基。
用500微升预热的DPBS洗涤每个孔，将培养板置于37摄氏度培养箱中孵育5分钟。5分钟后，弃去DPBS。加入500微升类器官培养基，其中含有足量病毒颗粒，以达到0.1的感染复数。
将培养板放入含5%二氧化碳的37摄氏度培养箱中孵育1小时，每20至30分钟轻轻手动摇晃培养板。将铺板所需量的基底膜提取物从-80摄氏度保存条件下转移至4摄氏度，使其解冻8小时。在光学显微镜下检查VEO，评估其大小和整体健康状况。
确认VEO的直径约为100微米，形态均匀呈圆形，且单细胞数量极少。从VEO孔中吸除细胞培养基，每孔用500微升维持在2至8摄氏度的冷无菌DPBS洗涤一次。去除DPBS后，向每孔加入200至500微升冷类器官收获溶液，确保其体积至少为基底膜提取物液滴体积的10倍。
然后使用经BSA包被的P200移液枪，机械性地破坏基底膜提取物。现在将培养板置于摇床中，于4摄氏度、约100转/分钟的条件下振荡20分钟。孵育结束后，用经BSA包被的移液枪头混匀并转移每孔中的内容物至经BSA包被的无菌15毫升锥形管中。
将离心管放入离心机，在4°C条件下以500 ×g离心5分钟，然后弃去上清液。用5至10毫升冷的DPBS洗涤VEO沉淀，再在4°C条件下以500 ×g离心5分钟。
吸去 DPBS，然后使用 P1000 移液器吸头将沉淀重悬于 1 毫升 T 细胞类器官培养基中，将 VEO 悬液置于冰上，直至 T 细胞准备好进行共培养。收集 T 细胞时，在光学显微镜下检查静息状态的 T 细胞，评估其大小和整体状态。确认 T 细胞出现一定程度的聚集成簇、形态增大，且无可见的细胞碎片或残骸。
使用 P1000 移液器，通过在孔板的每个角落反复吹打数次，重悬 T 细胞。收集至离心管中，并计数活 CD8 T 细胞的总数。接着，将 T 细胞悬液放入离心机，在 4°C 条件下以 584 G 离心 5 分钟。
弃去上清液，将T细胞沉淀重悬于10毫升T细胞类器官培养基中。然后将适量的T细胞转移至含有先前制备的VEO的锥形管中以混合细胞。将混合后的VEO与T细胞悬液放入离心机，在4摄氏度下以584 ×g离心5分钟。
弃去上清液后，将VEO和T细胞重悬于适当体积的基底膜提取物中。然后使用另一枪头，将悬液接种至预热的组织培养板中，每孔加入20微升，用于24孔板。随后将组织培养板倒置，放入37摄氏度的培养箱中。
静置30分钟，以确保基底膜提取物完全黏附并凝固。孵育结束后，小心地向每孔加入添加了补充成分的完全T细胞类器官培养基。对于24孔板，每孔加入500微升；对于96孔板，每孔加入250微升，加样时应沿孔壁缓慢加入，避免扰动基底膜提取物液滴。
每两天更换一次培养基，直至收获样本进行流式细胞术分析。感染了表达黄色荧光蛋白的淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒的7日龄小鼠VEO，在共培养后4小时即可观察到强烈的病毒复制，表现为类器官内的荧光信号。在共培养的后期时间点，CD8 T细胞在感染类器官周围聚集的现象变得显著。
CD8 T细胞的进行性聚集与感染类器官在后期时间点黄色荧光蛋白信号的明显减弱相关。与感染的VEO共培养的CD8 T细胞随时间推移表现出CD69和CD103表达升高，提示获得了组织驻留记忆表型。与未刺激对照组相比，经抗原刺激的CD69阳性、CD103阳性CD8 T细胞内干扰素γ和白细胞介素2的产生显著增加。
本方案可实现对CD8驻留记忆T细胞的体外研究，能够在不依赖动物模型的情况下高效操控上皮细胞和T细胞。该方案中最重要的挑战是维持T细胞和阴道上皮类器官的健康与活性，因为细胞活力低下或发生感染将影响共培养的存活率及实验结果。我们重点采用了流式细胞术分析，但共培养样本也可用于染色、成像和测序。
安全的培养基可用于后续的ELISA实验。
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概述
本方案展示了一种利用类器官-T细胞共培养系统研究CD8驻留记忆T细胞分化的实验方法。该方法可在可控的体外环境中探究T细胞的免疫应答，对于理解女性生殖道中的免疫反应至关重要。
关键研究组成部分
科学领域
- 免疫学
- 感染生物学
- 细胞培养技术
背景
- CD8 T细胞在免疫应答中发挥关键作用。
- 组织驻留记忆T细胞对长期免疫至关重要。
- 现有研究这些细胞的方法存在局限性。
- 类器官模型提供了更接近生理条件的环境。
研究目的
- 建立一种可扩展的体外系统，用于研究 CD8 T 细胞分化。
- 评估感染对 T 细胞驻留特性及功能的影响。
- 评价组织驻留记忆 T 细胞标志物的获得情况。
使用的方法
- 从小鼠中分离CD8 T细胞。
- 将T细胞与感染的阴道上皮类器官共培养。
- 通过流式细胞术分析评估T细胞标志物。
- 随时间监测病毒复制和T细胞反应。
主要结果
- 类器官感染导致T细胞聚集。
- CD8 T细胞表现出记忆标志物表达增加。
- 刺激后的T细胞显著产生细胞因子。
- 该方法可用于在体外对T细胞行为进行详细研究。
结论
- 该方案可高效研究CD8驻留记忆T细胞。
- 它有助于深入了解T细胞在感染背景下的免疫应答。
- 该方法可能减少T细胞研究对动物模型的依赖。
常见问题
行业重要性概述
在生理相关的上皮类器官系统中模拟 CD8 T 细胞分化，填补了黏膜屏障组织中免疫靶点验证的关键空白。该体外共培养平台可对上皮细胞与T细胞相互作用的机制进行去风险化分析，从而提升早期免疫学发现和转化研究的可预测性。该方法可对组织驻留记忆T细胞（TRM）生物学进行可扩展的简化分析，直接为免疫治疗开发的项目决策提供依据。
生物制药研发中的战略应用
早期发现与靶点验证
- 可探究上皮细胞来源的信号对CD8 T细胞分化的驱动作用。
- 支持在可控且与疾病相关的系统中对免疫靶点进行功能验证。
- 通过分离影响组织驻留记忆T细胞（TRM）表型获得的变量，有助于实现机制层面的风险评估。
- 为保护性免疫机制的假设驱动型研究提供平台。
筛选与检测方法开发
- 为后续的表型和功能检测制备经过验证的类器官-T细胞共培养体系。
- 标准化定量流式细胞术和细胞因子检测方法，实现可重复的免疫谱型分析。
- 支持对影响T细胞驻留和功能的调节因子进行可扩展的筛选。
- 在生理相关背景下支持化合物评价的检测方法开发。
转化与临床前研究
- 将体外研究结果与疾病相关的黏膜组织生物学特性相结合，实现转化研究的连续性。
- 通过模拟感染驱动的T细胞应答，支持对免疫靶点进行风险评估后的推进。
- 通过定量分析组织驻留记忆T细胞（TRM）相关标志物和细胞因子，助力生物标志物的发现。
- 提供组织特异性免疫的机制性见解，促进临床前决策制定。
流程与工作流整合
这种共培养系统通过在可扩展的体外体系中进行假设验证、通路解析以及功能性免疫靶点确认，架起了早期发现与临床前研究之间的桥梁。
- 发现生物学：支持对上皮信号在组织驻留记忆T细胞（TRM）分化中作用的零假设检验。
- 筛选：提供可重复且定量的输出结果，用于免疫表型分析和细胞因子分析。
- 分析：提供适用于流式细胞术和ELISA的检测读数，用于不同条件间的比较分析。
- 转化研究：模拟屏障组织中由感染驱动的免疫应答，以实现临床前研究的对接。
- 企业级复用：提供可重复使用的平台，可适配多种上皮细胞和T细胞来源。
运营与企业影响
- 科学价值：提高免疫靶点验证的预测可信度，降低机制上的模糊性。
- 操作价值：标准化共培养及分析流程，提升可重复性与可扩展性。
- 战略价值：通过实现免疫靶点的早期去风险化，改善决策判断并提高资金使用效率。
- 项目组合影响：支持基于风险调整的免疫治疗候选物优先排序与推进。
实施注意事项
- 需要具备类器官培养、T细胞分离及共培养技术方面的专业知识。
- 需要具备流式细胞术、成像和ELISA等定量分析所需的设备与基础设施。
- 需要跨团队对细胞活力和感染实验方案进行标准化。
- 通过优化实验方案，可适用于其他上皮细胞和T细胞来源。
- 依赖于维持类器官和T细胞的高存活率，以获得可靠的结果。
