基于高效再生的农杆菌介导的水生无性繁殖十字花科植物 Rorippa aquatica 的遗传转化

我们解决了非模式植物缺乏简单、可扩展的农杆菌转化流程的问题，从而实现了对基因功能的分子分析。最近，全基因组和生理基因表达研究将蔊菜（Rorippa aquatica）引入作为异形叶性的模式植物。该物种在研究陆生到水生适应的分子机制方面具有重要价值。

首先，选择具有完整叶缘且生长健康的两个月大种苗。准备一个尺寸为20厘米×30厘米的植物繁殖托盘，并在其中放置两层 autoclave 纸巾。将纸巾整齐折叠后，用无菌水充分浸润，直至表面形成一层薄水膜。

确保实验台配备有100至500毫升的双蒸水、适合预期重悬接种物体积的无菌容器、微量移液器以及相应的移液器吸头。现在，使用剪刀从选定的母本植株上快速切下10片花瓣基部的叶片，并将其放入含有无菌水的培养皿中。2.5小时后，向每升重悬液中加入50微升表面活性剂，以达到0.005%的表面活性剂浓度。

轻轻摇动烧瓶以混匀溶液，并确保已准备好繁殖托盘，以便在接种后放置外植体。将叶片置于背面朝上的位置。使用解剖刀沿叶片中脉垂直切割，切成长度为1厘米的小段，然后将其放入适合在旋转摇管仪中使用的50毫升离心管中，作为接种用外植体。

将农杆菌接种液倒入试管中，加入的体积需足以完全浸透所有外植体材料。将试管置于旋转混合器上，在室温下振荡10分钟以完成接种。然后用镊子将所有接种过的叶片外植体从溶液中取出，并直接放入已准备好的繁殖托盘中。

将浸泡过的外植体分开并均匀铺开，使其部分浸入饱和纸巾表面的薄层水中，但不要完全浸没。接着，用保鲜膜密封繁殖托盘。将托盘置于黑暗环境中，在22°C的环境温度下培养三天。

暗培养期结束后，确认培养皿仍用透明塑料膜密封。根据需要向培养皿中添加双蒸水，以维持湿度水平。将接种后的培养皿转移至生长室，并在营养繁殖条件下培养。

目视检查再生莲座状植株幼苗是否适合移栽。通过确认幼苗具有完整的叶鞘、多片叶片以及长度至少为两到三毫米的根系，来判断其是否符合理想标准。随后，使用镊子切除完整且带有转基因特征的莲座状植株幼苗。

将切除的植株在与野生型克隆再生相同条件下进行移植。切除莲座状植株时需小心操作，避免接触任何转基因叶片。立即修剪转基因叶片周围多余的枝叶，并每盆移植单个植株。

每株移栽植物施肥后，充分浇水，喷雾润湿叶片，并将植株置于适宜条件下。最后，将含有无芽或无根转化体、或体型过小不宜移栽的外植体重新放回增殖培养盘中。继续筛选这些外植体，待其生长至足够大小后再进行移栽。

在一个月大的 our one T one 幼苗中，大多数表现出嵌合型 ruby 表达模式，而少数幼苗的叶片则完全表达 ruby。在维持生长至六个月大的 our one T one 幼苗中，均表现出嵌合型 ruby 表达。从 our one T one 幼苗中切取的具有嵌合型 ruby 色素的叶片区域能够进行无性繁殖。

切除的嵌合型叶片片段在切除后两到四周内再生为完全表达红宝石荧光蛋白的植株或嵌合型植株，即一T一莲座叶植株，在再生过程中可见根系形成。一个月后，大多数两T一幼苗表现出 predominantly 红宝石荧光蛋白标记的叶片。我们的方案绕过了无菌组织培养步骤，为缺乏种子或花朵的无性繁殖植物提供了一条转化与再生的技术流程。

我们关于水生蔊菜在淹没条件下乙烯信号通路激活的研究，为陆生植物对淹没胁迫的响应机制提供了关键见解。本方法为进一步探究光信号与激素通路如何调控这种两栖植物在水下发生形态转变奠定了基础。