免疫染色与染料渗透实验用于确定核心皱褶型紧密连接蛋白 果蝇 胚胎上皮

我们的研究探讨了隔膜连接蛋白在发育过程中的非封闭性功能，重点是鉴定并表征参与其结构与生物学功能的新组分。本实验方案旨在表征黑腹果蝇（Drosophila）胚胎外胚层上皮中褶皱型隔膜连接的组织结构及其封闭功能。首先，将具有适当基因型的健康雄性和雌性黑腹果蝇进行杂交，并将其放入配备新鲜苹果汁培养基（表面涂抹酵母糊）的胚胎收集笼中。

让成虫在苹果汁培养基上产下受精卵。将培养基从收卵笼中取出，在25摄氏度下使胚胎发育13至16小时，以达到16期。随后将16期胚胎置于适当的固定液中固定，并用目标抗体进行免疫染色。

为获得最佳结果，应使用配备40倍油浸物镜的共聚焦显微镜对胚胎进行成像。聚焦于目标胚胎后，调节激光强度和增益，以获得较强的荧光信号，同时避免任何像素过饱和。根据中肠形态，鉴定不表达平衡染色体编码的绿色荧光蛋白的16期胚胎。

将扫描聚焦于唾液腺或后肠，并调整Z轴扫描范围，以包含管腔尽可能大的直径，从而观察上皮细胞完整的侧膜。设置适当的扫描线平均值，并对至少20个对照组和20个Cora 4突变型16期胚胎中的极化组织进行成像。仅记录那些黏附连接标记物紧密定位于膜顶端-侧向区域的胚胎数据。

在野生型16期胚胎中，检测褶皱型隔膜连接蛋白在侧膜顶端区域靠近黏附连接处的富集情况。记录该褶皱型隔膜连接标志物在突变体中沿整个侧膜持续分布的现象。配制新鲜染料溶液：将罗丹明标记的10千道尔顿葡聚糖溶解于pH 7.5的0.5摩尔磷酸钠溶液（含5毫摩尔氯化钾）中，浓度为1毫克/毫升。

使用拉针仪，将一根外径为1毫米、内径为0.5毫米并带有纤维的毛细管拉制成玻璃针。接着，将玻璃针装入显微操作仪的针夹持器中，并将显微操作仪放置在倒置显微镜旁。调整玻璃针的方向，尽可能使其与显微镜载玻片平行，并将其降低至与载玻片侧面相同的Z平面。

通过将针尖撞击载玻片侧面来折断针尖。将针抬高至载玻片水平以上，取出针进行装样。接着，使用最小的移液器吸头将染料注入毛细管中。

将装满液体的针头重新装入针头架中。通过向显微镜载玻片表面的一滴卤代烃油中注入少量10千道尔顿的葡聚糖，测试其流动情况。使用22 × 22毫米、厚度为2号的盖玻片，在苹果汁平板上划出一条凹痕。

在苹果汁培养基上，将约25个对照组和Cora 4突变体胚胎（16或17期）依次排列整齐，确保它们的后端对齐于一条直线，并使腹面朝上。然后将一片双面胶带贴在22 × 22毫米的2号盖玻片上。

将胶带接触胚胎线，并轻轻按压盖玻片，使胚胎从培养板转移到双面胶带上。接着，在显微镜载玻片上滴加一滴卤代烃油，通过毛细作用使盖玻片与载玻片粘合固定。将盖玻片朝向载玻片上无磨砂区域的一侧放置。

将胚胎置于干燥剂容器中干燥3至5分钟，并用卤代烃油完全覆盖胚胎。将带有胚胎的载玻片安装到倒置显微镜上，使胚胎朝上且背向物镜。调整显微操作仪，使针头对准胚胎的后端，角度尽可能与胚胎平行，并调节显微操作仪的Z轴，使针尖与胚胎背腹轴中点对齐。

接下来，通过快速移动载物台使胚胎接触针头，让针尖进入血腔。使用10-25或50毫升的注射器注入约0.2至0.5纳升的染料。迅速抽出针头，并将载物台移至下一个胚胎以进行染料注射。

然后在胚胎上方加入更多的卤代烃油。用一块22 × 22毫米、厚度为2号的盖玻片覆盖胚胎，以在盖玻片之间形成均匀的油层，并防止压碎样本。在注入葡聚糖染料后，使用荧光复合显微镜或共聚焦显微镜进行成像。

在共聚焦显微镜下，沿胚胎背腹轴方向获取约四分之一胚胎深度的Z轴层扫图像，以评估气管管腔。观察气管、唾液腺或后肠管腔中是否存在标记葡聚糖的积累。记录每个胚胎的基因型、发育阶段，以及标记葡聚糖是否在任何管状器官中积累。

注意那些胚周隙被染料强烈染色的胚胎，因为这可能代表染料意外注入了该区域。在野生型胚胎中，大球蛋白补体相关蛋白（macroglobulin complement-related，Mcr）在13期均匀定位于侧膜，在14期富集于侧膜的顶端区域，到16期则强烈定位于粘附连接下方的顶-侧区域。皮层抗体染色显示，在16期野生型胚胎中，成熟的褶皱隔膜连接的定位模式与Mcr相似。

在Cora 4突变体胚胎中，Mcr在16期未能实现明显的顶端定位，仍沿侧膜分布。E-钙黏蛋白在野生型和Cora 4突变体16期胚胎中的定位相似。在注射了罗丹明标记的10千道尔顿葡聚糖的野生型17期胚胎中，染料围绕气管分布，但未进入管腔内部。

在Cora 4突变体17期胚胎中，染料在注射后10分钟内即在气管腔内聚集。该方案可使研究人员明确判断某个基因是否编码果蝇胚胎组织中褶皱型隔膜连接的核心组分或辅助组分。在执行该技术时，胚胎分期极为关键，因该实验必须使用16期胚胎。

隔膜连接会随着时间逐渐成熟，直至在16期完全形成。我们认为，该方案可有效应用于基于RNA干扰品系的开放式遗传筛选，以鉴定新的褶皱型隔膜连接基因。