建立早孕期母体免疫激活小鼠模型以评估产前炎症对神经发育的影响

我们的实验室研究产前炎症如何改变小胶质细胞（大脑的免疫细胞）的生物学特性，进而导致不良的神经发育结局。现有的母体免疫激活（MI）模型主要集中在妊娠中期，而我们则提出了一种早期妊娠阶段的实验方案，并且引入了质量控制指标，以提高动物存活率和实验结果的一致性。

该模型可应用于任何野生型或遗传型小鼠模型，以探究环境炎症对大脑发育的影响。首先，在傍晚或晚上，将两只8至10周龄的C57 BL6雌性小鼠与C57 BL6种用雄性小鼠合笼。次日早晨，检查雌性小鼠阴道栓情况，并继续每天检查一次，直至发现阴道栓为止。

栓塞物为暂时性的，若未在早晨检查，可能在下午前脱落。确认阴道栓后，称量雌性小鼠体重，并记录体重数据，通过监测整个妊娠期间的体重增长来评估妊娠状态。将发现有栓塞的雌性小鼠分至单独的笼具中，在标准饲养条件下饲养，自由摄取食物和水。

将发现阴栓的雌性小鼠定为胚胎发育第0.5天，并记录阴道栓出现日期，以准确追踪妊娠周期。为将冻干的聚肌胞苷酸（poly IC）重悬为高浓度储备液，请根据生产商说明书将其溶解于无菌生理盐水或无菌水中。涡旋混匀高浓度储备液。

然后，用生理盐水稀释该溶液以制备低浓度储备液。为避免反复冻融，将约125微升低浓度储备液分装至1.5毫升离心管中，并将离心管置于-20摄氏度或-80摄氏度保存。在胚胎发育第9.5天注射前立即使用。

用无菌生理盐水稀释低浓度的聚肌胞苷酸（poly IC）储备液，以获得工作浓度。将工作液在65摄氏度加热10分钟，以确保双链核糖核酸结构正确复性。然后涡旋振荡或用移液器吹打溶液，以确保在注射前形成均匀的混合物。

为确认妊娠，在胚胎发育第9.5天早晨称量母鼠体重。计算用于母体免疫激活（MIA）的聚肌胞苷酸（poly-IC）注射体积，以及对照组所用0.9%生理盐水的注射体积。将适量的已配制poly-IC工作溶液或生理盐水吸入无菌的27号或更小规格的注射器中。

现在，正确固定母鼠以尽量减少疼痛和不适。将聚肌胞苷酸（poly-IC）溶液或生理盐水注射至左下或右下腹象限，注射部位位于髋部水平稍上方，或第二对乳头处。随后将注射器丢弃至生物安全锐器容器中。

同时，记录注射侧以保持整个队列的一致性。立即将母鼠放回其饲养笼，并监测是否有任何不适迹象。随后在注射后至少24小时内为笼内补充水凝胶，以防止与病态行为相关的脱水。

之后，记录聚肌胞苷酸（poly-IC）注射剂量、注射体积、注射日期与时间、妊娠周龄以及poly-IC批号。注射后3小时，对每只小鼠单独观察1分钟，使用三分制评分系统评估其行为表现，包括活动减少、蜷缩姿势、面部痛苦表情或稀便等情况。将表现出上述一种或多种行为的小鼠归类为出现急性病态行为。

然后，采用尾静脉微量采血等微创方法，小心地从注射后的母鼠采集母体血液。采集约 50 µL 血液。确认止血后，将母鼠放回原笼中。

将采集的血液在室温下静置30分钟，使其凝固。在室温下以2000 G离心5分钟，使血清与血块分离。再次离心样品后，小心收集上层澄清的血清层，避免扰动血块。

将血清在20摄氏度保存，直至进行下游细胞因子分析。注射后，连续三天每天称量母鼠体重，以监测其对聚肌胞苷酸（poly IC酸）的反应。在预计分娩当天，记录产仔结果，包括产仔数、仔鼠存活率，或无产仔以表明妊娠未成功。

立即移除任何死亡的仔鼠，并根据机构的生物安全指南进行处理。在MIA或对照注射后，按照试剂盒制造商的说明，使用ELISA或多因子检测法对母鼠血清中的炎症性细胞因子（如IL-6和TNF-alpha）进行定量。定量完成后，利用结果建立MIA反应的代表性阈值。

最后，使用我们的软件进行统计分析，以评估母体血清中IL-6与TNF alpha水平之间的关系。在胚胎第9.5天给予聚肌胞苷酸（poly IC）后，母体免疫激活（MIA）组孕鼠的IL-6水平较对照组孕鼠显著升高。TNF alpha水平与母体IL-6水平呈显著正相关。

在胚胎发育第0.5天至第9.5天期间，成功产下幼崽的母鼠体重增加显著高于未能产下幼崽的母鼠。注射后一天，MIA母鼠体重下降，而生理盐水处理的对照组母鼠体重增加。但到胚胎发育第12天时，两组母鼠的体重增加情况相似。

孕前体重对生理盐水处理的对照组或MIA母鼠的产仔效率均无影响。然而，在MIA操作过程中，来自杰克逊实验室的C57 BL6小鼠比来自查尔斯河实验室的C57 BL6小鼠产仔成功率更高。相比之下，聚IC的来源对产仔效率无影响。

此外，与来自查尔斯河实验室的动物相比，来自杰克逊实验室的动物表现出更强的母体炎症反应，这通过血清 IL-6 水平测定得以证实。相比之下，不同来源的聚肌胞苷酸（poly IC）所诱导的母体炎症反应程度相似。该方案可实现早期母体免疫激活（MIA）模型的可重复构建，并将母体炎症严重程度与子代实验结果相关联。为确保结果的可重复性，必须详细记录实验信息，追踪试剂的批号，并评估所有母体的细胞因子反应。