高效分离猪脂肪组织来源的间充质干细胞和脂肪细胞

本研究的目的是高效且快速地从脂肪组织中分离细胞。传统的消化方法耗时较长，且可能导致过度消化。我们采用的酶解与机械波处理方法可实现温和的组织分散，并缩短分离时间。

首先，将安乐死后的猪的背部皮下脂肪组织取一小块置于培养皿中。沿脂肪组织与真皮层之间的自然层面进行解剖，以获得完整、厚度为两到三毫米的ULB组织片。用冰冷的无菌生理盐水冲洗ULB一次。

撕开无菌培养皿后，将组织置于无菌培养皿中，在预先灭菌的天平上称重。每1.8克组织加入10毫升冰冻的D-Hank's缓冲液，并保持组织完全浸没。使用无菌手术剪识别并切除组织中所有可见的血管。

去除任何结缔组织和纤维化成分。将切除的材料丢弃至指定的生物危害容器中。用D-Hank's缓冲液冲洗组织，以去除残留的血液和碎片。

撕开培养皿后，将组织置于已预消毒的天平上称重。取1.8克冲洗后的组织碎片转移至无菌的1.5毫升微量离心管中。向管中加入800微升A型组织解离缓冲液。

使用无菌眼科剪将管中的组织剪切成约一至二立方毫米大小的碎片。将组织碎块连同周围的缓冲液转移至新的微量离心管中。向管中加入 200 µL A 型组织解离试剂。

用手轻轻旋转并摇动试管三次，以混匀内容物。确保脂肪组织碎片完全浸没在解离液中。检查试管盖是否已紧密闭合。

将试管放入37摄氏度的金属浴中，孵育5至10分钟。将缓冲液中部分消化的脂肪组织转移至指定用于机械解离系统的无菌1.5毫升微量离心管中。运行脂肪组织的预设程序，使用200赫兹正弦波进行机械解离。

收集细胞悬液，通过200微米细胞筛网过滤至新的50毫升离心管中。向筛网中加入5毫升4摄氏度预冷的D-Hank溶液，用D-Hank溶液冲洗筛网两次。

将过滤后的细胞悬液在4°C条件下以500 G离心5分钟。使用无菌巴斯德吸管吸除并弃去上清液中的脂质层，同时保留1毫升缓冲液以保护脂肪细胞层。收集含有脂肪细胞的第二层，注意不要扰动第三层和第四层。

吸出并弃去第三层。向含有基质血管组分（SVF）的底部沉淀中加入1毫升D-Hank's缓冲液。轻轻重悬细胞沉淀，使细胞浓度达到每毫升2×10⁶至5×10⁶个细胞。

在1.5毫升微量离心管中制备SVF细胞悬液。使用前将悬液置于冰上保存。取10微升SVF细胞悬液和10微升0.4%台盼蓝溶液，加入无菌的0.5毫升微量离心管中。

轻轻吹打混匀三次。取10 µL染色后的细胞混合液转移至适用于自动细胞计数仪的计数板中。确认样品完全充满计数室，且无溢出。

将计数板插入自动细胞计数仪中。选择台盼蓝染色检测类型，并根据需要调整细胞浓度范围。按下“计数”按钮以启动自动细胞计数。

监测计数室图像，观察仪器对活细胞和死细胞的自动区分。记录仪器屏幕上显示的细胞活力百分比及活细胞总数。对每个样本进行三次独立测量。

计算每克脂肪组织的平均细胞活力和细胞产量。用含有5微克/毫升huksed和1微摩尔BODIPY的D.Hank's溶液配制染色液。将分离的脂肪细胞在染色液中于37摄氏度孵育15分钟。

使用自制的脂肪细胞友好型载玻片盖玻片系统，制备适用于荧光显微镜观察的样品。这种自制的脂肪细胞友好型封片系统可实现完整脂肪细胞的均匀分布，从而获得清晰的成像效果。与传统方法产生的拥挤、多层排列不同，所提取的脂肪细胞保持了完整的结构和正常的形态。

通过机械解离方法获得的脂肪细胞存活率显著高于传统的酶解水解方法。纯化并培养的脂肪来源干细胞表现出均匀的成纤维细胞样形态，细胞呈细长的梭形，排列有序。大多数细胞未被染色，表明其具有活性，仅有少量细胞被染成蓝色，代表死亡细胞。

本方案可使研究人员比较不同脂肪库中分离的细胞特征。通过本方案获得的基质血管组分（SVF）可用于类器官构建和脂肪干细胞纯化。未来的研究可进一步优化分离方法，以考虑不同脂肪库间细胞外基质的脂肪组织差异。