利用液滴界面双层膜表征脂质-蛋白质膜的结构与功能

本研究探讨了脂质膜及其环境的物理和电学特性如何影响液滴界面双层模型系统中的离子传导。传统的膜片钳电生理学技术无法研究更大尺度的膜生物物理学特性，而该单一平台既能检测单通道活性，又能研究毫米尺度更大面积的膜区域，从而更全面地研究膜生物物理学。首先，为电生理实验制备氯化银-琼脂糖包被的银丝电极和脂质体溶液。

进行液滴界面双层膜形成时，将底部透明的培养皿置于倒置显微镜的载物台上。向培养皿中加入烷烃油（如100%十六烷），深度约为五毫米。将电极连接至膜片钳头级和接地电极支架后，使用显微操作器控制装置，将两端涂有琼脂糖的小球缓慢浸入油中，深度约为油面以下2.5毫米，避免快速移动，以防与培养皿发生碰撞。

调节显微镜焦距，直至两个球形末端及其琼脂糖包被均清晰对焦。将电极置于视野边缘附近，以便同时观察两个电极。使用经校准的两微升移液器，吸取掺有短杆菌肽A的DPhPC脂质体悬液。使用不同的移液器吸头，缓慢将250纳升悬液直接滴加到每个包被琼脂糖的球形末端上，操作时避免接触琼脂糖外壳。

让液滴在琼脂糖表面铺展，并因重力和表面张力降低而明显向下垂坠，形成悬垂液滴的形状。若培养皿壁透明，可从侧面透过皿壁观察液滴下垂情况。五分钟后，轻轻推动防震台以评估液滴状态。

确认下垂的液滴相对于电极运动有轻微延迟，表明已形成完全包被脂质单层的液滴。如果未观察到此现象，需额外等待两到三分钟，并重复评估。确保显微镜、防震台、法拉第笼、放大器、数字化仪、函数发生器和计算机均连接至共用地线。

根据制造商的安装指南连接仪器，并按照双水相界面双层膜实验的详细说明，配置必要的电学和光学装置。配置外部函数发生器或采集软件输出通道，以生成频率为10赫兹、幅值为10毫伏的三角波电压信号。在连接的示波器及采集软件中确认该信号的幅值和频率。

在液滴下垂约10分钟后，使用显微操作器将两个液滴轻轻接触。开启10赫兹、10毫伏的三角波形，并在采集软件中监测电容性电流响应。通过轻微移动电极调整液滴接触面积，直至波形引起的峰-峰电容性电流响应处于约100至200皮安之间。

或者接触面积不超过液滴直径的约1/4。等待自发放生的双层膜形成，其电学特征表现为峰-峰值电容电流响应逐渐扩大，光学特征表现为接触区域内部反射增强并呈现椭圆形。确认纯脂质双层膜在三角波电压刺激下表现出矩形的电流平台，而掺有短杆菌肽A（gramicidin A）的双层膜则表现出倾斜的平台，反映离子电导的集合行为。

确认获得稳定的电容性或导电性响应后，关闭三角波信号，使液滴界面双层膜至少平衡15分钟，然后开始施加刺激方案。在视频采集软件中，将帧率设置为至少每秒20帧。选择合适的相机和物镜参数设置。

接下来，点击“采集”并选择“新建方案”。在采集模式选项卡中，选择“事件相关刺激”。将每次试验的运行次数和每次运行的扫描次数均设置为1。

将扫描持续时间调整为比总实验持续时间长四秒，以留出刺激前和刺激后各两秒的基线期。将采样率设置为每秒5至10千赫兹。在“输入”选项卡中，将记录通道指定为当前输入。

然后，在“输出”选项卡中，将刺激通道分配给控制电极的电压输出。打开“波形”选项卡，在A列中，将类型设置为“阶跃”，初始电平和变化电平均设为0毫伏，初始持续时间设为2,000毫秒，以定义刺激前基线。

在B列中，为成对脉冲易化设置类型为脉冲。设定第一次持续时间及第一次电压幅度值，并设置脉冲序列频率以定义对应于目标占空比的脉冲间间隔。将脉冲宽度调整为100毫秒。

在C列中，针对成对脉冲抑制，将类型设置为脉冲，其幅度和脉冲持续时间与之前相同。设置脉冲序列频率以达到所需的较低占空比，并设定脉冲宽度。接下来，在D列中，将刺激后参数配置为与刺激前基线完全相同。

查看实验方案，并使用描述性名称保存。开始视频录制，同时立即点击各软件中的“记录”按钮，启动电生理信号采集和刺激。在刺激开始的前60秒内，观察电流是否上升并可能达到平台期。

在最后60秒内，观察到电流逐渐减小。在程序结束时，同时停止电生理信号采集和视频记录。最后，进行后期处理，从成像和电生理数据中提取膜面积，并计算归一化的电流、面积和通量。

当两个下垂的液滴接触时，连续图像捕捉到了双层膜自发 zipper 式闭合及面积扩张的过程。通过液滴接触处明亮的内侧椭圆形反射区域，可随时间推移估算双层膜的直径和膜面积。采用持续 100 毫秒的脉冲，在 0 至 60 秒期间施加成对脉冲易化，随后在 60 至 120 秒期间施加成对脉冲抑制。

记录了在开启期间的代表性电流响应以及刺激模式。在成对脉冲易化和成对脉冲抑制过程中，展示了含有短杆菌肽A的DPhPC双层膜在十六烷和十二烷/十六烷油中的归一化电流。在30个时间点测得的归一化膜面积显示，尽管电流不同，但在两种油条件下膜面积的变化趋势相似。

标准化通量分离了与面积无关的电导变化，与膜电导的变化一致，超出了简单的面积扩张效应。长达30分钟的扩展配对脉冲抑制刺激在十六烷膜中产生了类似长时程抑制的行为，但在十二烷/十六烷膜中仍维持升高的通量，与类似长时程增强的行为一致。该方案使我们能够测量膜结构和离子传导如何通过电驱动的液滴界面双层重构而发生变化。

该平台可在含有离子通道、不含离子通道，甚至含有光异构化通道的双层脂膜中支持多种不同的刺激方案，从而更深入地探究膜的动力学特性和电学性质。由于这一可调谐平台能够同时检测宏观和微观尺度的膜生物物理特性，未来若结合荧光光谱技术进行实验，将能更可靠地区分蛋白质通道活性与膜孔导电性。